前言：　　脑胶质瘤是颅内最常见的原发性肿瘤，具有高发病率、高复发率、高病死率、低治愈率等特点。近年来，化学治疗已经成为脑胶质瘤特别是恶性脑胶质瘤患者的主要治疗方式。如今化疗广泛应用于临床治疗，然而单一药物的应用常出现肿瘤耐药等现象，故化疗药物的联合应用已成为一种趋势。　　紫杉醇提取自从紫衫树皮并作用于微管蛋白。它可加速微管二聚体形成微管，并防止其分离并抑制细胞的正常分裂;同时抑制其他因素对微管系统的作用，最终诱导细胞凋亡。紫杉醇对多种肿瘤具有很好的疗效，尤其针对耐药性的肿瘤也取得了较好的进展。研究表明，ERK信号通路可促进细胞的分化与增殖，紫杉醇通过诱导细胞凋亡从而起抗癌作用的途径可能与之相关。　　紫草素作为传统中药材紫草的主要有效成分，已被证明具有抗炎、抗癌、调节免疫力等作用。紫草素类化合物的抗肿瘤作用机制主要包括诱导细胞自噬、凋亡、坏死，抑制蛋白酪氨酸激酶及拓扑异构酶，同时通过影响肿瘤细胞的信号通路达到预防和治疗肿瘤的目的。　　紫杉醇和紫草素均为稳定、高效的化疗药物，可通过对肿瘤细胞周期的阻滞及促进细胞凋亡而发挥抑制肿瘤生长、迁移及侵袭的作用。研究证实，紫杉醇和紫草素可分别增加及抑制p-ERK蛋白的表达。本研究的目的旨在首先探讨是否可以通过应用紫草素来抑制紫杉醇对p-ERK蛋白表达的上调，从而提高紫杉醇的化疗效果，进一步研究是否可以通过两者的联用实现化疗药物的协同作用，产生更好的抗癌效果，这为今后紫杉醇治疗胶质瘤及化疗药物的联合应用提供了一定的实验依据。　　实验材料和方法：　　一、实验材料　　（一）实验细胞株　　人U87胶质母细胞瘤细胞株由中国医科大学细胞生物重点实验室提供。　　（二）主要试剂　　紫草素（中国药品生物制品检定所）;CCK-8（北京鼎国生物科技有限公司），DMSO，紫杉醇（美国Sigma公司），DMEM培养基（美国HyClone公司）;胎牛血清（北京鼎国生物科技有限公司）;Annexin Ⅴ/PI细胞凋亡检测试剂盒（北京宝赛生物技术有限公司）;细胞周期检测试剂盒（北京鼎国生物科技有限公司）;小鼠抗p-ERK单克隆抗体，兔抗总ERK单克隆抗体（Abcam公司）;山羊抗兔HRP标记的IgG二抗，山羊抗小鼠HRP标记的IgG二抗。　　（三）主要仪器　　细胞培养箱（美国Forma scientific公司）;超净工作台（苏州安泰空气技术有限公司）;台式低温超速离心机（德国Sigma公司）;聚丙烯酰胺凝胶电泳装置（美国Bio-Rad公司）;转印仪（北京市六一仪器厂）;Las3000成像系统（日本FUJIFILM公司）;凝胶成像分析软件（江苏捷达科技有限公司）;电子分析天平（德国Sartorius公司）;-80℃超低温冰箱（日本SANYO公司）;恒温震荡水浴（哈尔滨市东联电子技术开发有限公司）;旋涡混合器（上海医科大学仪器厂）。　　二、实验方法　　（一）肿瘤细胞培养　　（二）实验分组　　1、对照组:PBS+U87细胞　　2、紫杉醇组:紫杉醇(4.5μmol/l)+U87细胞　　3、紫草素组:紫草素(2.5μmol/l)+U87细胞　　4、1/2紫杉醇+1/2紫草素组:紫杉醇(2.25μmol/l)+紫草素(1.25μmol/l)+U87细胞　　（三）CCK-8法检测细胞增殖活性　　（四）划痕实验观察细胞迁移能力　　（五）Transwell迁移实验测定细胞迁移能力　　（六）Transwell侵袭实验测定细胞侵袭能力　　（七）AnnexinⅤ-FITC/PI检测细胞凋亡　　（八）细胞周期　　（九）WesternBlot方法检测p-ERK/ERK的变化　　（十）统计学处理　　所有数值以均数±标准差（(X)±SD）表示，采用SPSS18.0统计软件对实验数据进行分析，组间比较采用单因素方差分析（Dunnett-t检验），P＜0.05为差异有统计学意义。　　实验结果：　　一、紫杉醇与紫草素单独以及联合应用抑制U87细胞增殖　　采用CCK-8法检测不同浓度的紫杉醇对U87细胞活力的影响。紫杉醇的给药浓度分别为0μmol/L，0.1μmol/L，0.5μmol/L，2.5μmol/L，12.5μmol/L，25μmol/L。紫杉醇以浓度依赖性作用方式显著抑制U87细胞活力。紫杉醇作用时间为24小时的U87细胞半数抑制率为8.97±0.23μmol/L。进一步应用9μmol/L紫杉醇观察了不同时间的细胞活力的变化，紫杉醇作用12h、24h、48h均显著降低了U87细胞活力。　　紫草素以浓度依赖性作用方式显著抑制U87绌胞活力，与0μmol/L相比，浓度为4μmol/L、8μmol/L的紫草素均显著抑制细胞活力。作用时间为24小时的U87细胞半数抑制浓度为5.02±0.44μmol/L。进一步应用5μmol/L紫草素观察了不同时间的U87细胞活力的变化，紫草素作用12h、24h、48h均显著降低了细胞活力。选择24h作为给药时间点，进行后续试验。　　选择浓度为1/4IC50、1/2IC50及IC50浓度作为联合应用时所用浓度，即分别选用浓度为2.25μmol/L、4.5μmol/L、9μmol/L的紫杉醇与浓度分别为1.25μmol/L、2.5μmol/L、5μmol/L的紫草素联合应用作用于U87细胞24h。CCK-8结果显示:两种药物的联用具有协同抑制U87细胞增殖的作用，其中4.5μmol/L紫杉醇与2.5μmol/L紫草素联合应用组具有显著的联用价值(CDI=0.72)。　　二、紫杉醇与紫草素单独以及联合应用抑制U87细胞迁移　　因紫杉醇及紫草素对U87迁移能力抑制较强，选用浓度为4.5μmol/L浓度紫杉醇、2.5μmol/L浓度紫草素及2.25μmol/L浓度紫杉醇联合1.25μmol/L浓度紫草素作用于U87细胞行划痕实验和Transwell法观察U87细胞迁移能力的变化。结果显示，在药物作用24h后，与对照组相比，紫杉醇组、紫草素组和1/2紫杉醇+1/2紫草素组分别显著抑制了U87细胞的迁移能力。与单独应用紫杉醇、紫草素相比较，1/2紫杉醇+1/2紫草素组更显著抑制了U87细胞的迁移力。　　三、紫杉醇与紫草素单独以及联合应用抑制U87细胞侵袭　　对照组以及4.5μmol/L紫杉醇、2.5μmol/L的紫草素及2.25μmol/L紫杉醇联合1.25μmol/L紫草素作用于U87细胞24h后，各组穿过含BD基质胶的Transwell小室的细胞个数分别是100±3.2个，65±2.4个，50±2.3个，27±3.3个。与对照组相比，紫杉醇组、紫草素组和1/2紫杉醇+1/2紫草素组分别显著抑制了U87细胞的侵袭能力。与单独应用紫杉醇、紫草素相比较，1/2紫杉醇+1/2紫草素组更显著抑制了U87细胞的侵袭力。　　四、紫杉醇与紫草素单独以及联合应用促进U87细胞凋亡　　单独应用紫杉醇与紫草素，以及1/2紫杉醇+1/2紫草素组于U87细胞24h后，对照组、紫杉醇组、紫草素组及联合应用组的凋亡率（含坏死细胞）分别是3.5±1.22％,28.4±2.89％，35.7±3.42％及40.6±3.76％;与对照组相比，紫杉醇组、紫草素组和1/2紫杉醇+1/2紫草素组分别显著促进了U87细胞的凋亡。与单独应用紫杉醇、紫草素相比较，1/2紫杉醇+1/2紫草素组更显著促进了U87细胞的凋亡(P＜0.01）。　　五、紫杉醇与紫草素单独以及联合应用对细胞周期的影响　　对照组，紫杉醇组、紫草素组及1/2紫杉醇+1/2紫草素组的凋亡率分别是0.18±0.43％，4.59±1.98％，0.54±0.80％，8.57±2.8％。同时各组G1期RNA含量分别是52.53±3.35％，24.35±2.45％，61.35±2.29％，28.73±3.24％;各组的G2期RNA含量分别是38.87±1.59％，63.73±2.62％，26.99±2.34％，57.63±3.54％;1/2紫杉醇+1/2紫草素组显著增加了U87细胞的凋亡率，同时紫草素组G1期的RNA含量增多，紫杉醇组及1/2紫杉醇+1/2紫草素组的G2其RNA含量显著增高。　　六、紫杉醇与紫草素单独以及联合应用对p-ERK表达的影响　　单独应用紫杉醇与紫草素以及1/2紫杉醇+1/2紫草素组于U87细胞24h后，对照组，紫杉醇组、紫草素组及1/2紫杉醇+1/2紫草素组的p-ERK/ERK的比值分别为0.62±0.07％，0.80±0.07％，0.35±0.08％，0.49±0.04％。与对照组相比，紫杉醇组p-ERK/ERK的比值显著增高（P＜0.05），紫草素组与1/2紫杉醇+1/2紫草素组的p-ERK/ERK比值显著降低(P＜0.05)。　　结论：　　1、与紫杉醇或紫草素单用组相比，两者半量联用通过协同作用能显著抑制U87胶质瘤细胞增殖、迁移、侵袭能力，促进细胞凋亡，阻滞细胞周期;　　2、紫杉醇与紫草素的协同效应机制与二者联合应用抑制p-ERK蛋白表达相关。