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两栖动物的性腺分化是当今发育生物学的研究热点。两栖动物属于变温动物,其生长和性腺分化均受到环境温度的影响,研究温度对两栖动物的生长和性腺分化的影响,对于两栖动物保护具有重要的理论价值。本文在大鲵(Andrias davidianus)幼体适宜生长的水温范围内,设置了 14℃、21℃、24℃等3个水温梯度,分3次测量每个水温梯度下大鲵幼体的体重,采用石蜡切片、HE染色技术对其进行性别鉴定,旨在探究水温对大鲵幼体生长与性腺分化的影响。在性别鉴定的同时,依据本实验室高通量转录组测序数据筛选出的差异表达基因,选取了与性别分化相关的基因Wnt4,采用原位杂交技术对Wnt4在大鲵幼体精巢和卵巢中的表达进行了定位,还运用实时定量PCR技术、Western Bolt技术对Wnt4 的表达进行了定量,以此来探究Wnt4在大鲵幼体精巢和卵巢中的表达差异及水温变化对Wnt4表达量的影响。主要结果与结论如下:1.水温对大鲵幼体生长的影响。大鲵幼体在14℃水温下生长最慢,24℃次之,21℃最快;在3个水温梯度条件下,大鲵幼体生长速度差异显著(P<0.05)。表明在14℃～2 1℃水温范围内,大鲵幼体的生长速率随水温的升高而加快,但水温高于2 1℃对大鲵幼体的生长有抑制作用。2.水温对大鲵幼体性腺分化比例的影响。14℃水温组取材的9尾大鲵幼体为3♀6♂,雌雄性别比为1:2,雌性率为33%。21℃和24♂水温组取材的9尾大鲵幼体都为3♀6♂雌雄性别比均为2:1,21℃、24℃两组大鲵的雌性率均显著升高至67%。表明高水温可使大鲵幼体性腺分化趋向于雌性,而低水温可使大鲵幼体的性腺分化趋向于雄性。3.水温对大鲵幼体性腺分化时间的影响。在3个水温梯度下,出膜约327 d的大鲵幼体性腺的分化时间差异较大:①14℃水温组的部分大鲵幼体性腺初步分化出原始卵泡,个别大鲵幼体的性腺还未出现分化。②21℃、24℃水温组大鲵幼体的性腺已全部分化且分化程度明显。本文认为,大鲵幼体的性腺分化对水温的变化较为敏感,高水温可使其性腺的分化时间提前,分化进程加快。4.Wnt4在大鲵幼体精巢和卵巢中的定位分析。Wnt4 mRNA在14℃水温组卵巢中的强阳性表达主要集中在卵巢边缘的体细胞以及与卵巢相连的肾小管上皮细胞,Wnt4 mRNA在精巢中的表达强度较弱,表达部位主要集中在与精巢相连接的肾髓质、皮质交界处的肾小管细胞中;Wnt4 mRNA在24℃水温组卵巢中的强阳性表达主要集中在卵泡细胞中,同时在与卵巢相连的肾小管细胞内也有强阳性表达,Wnt4mRNA在精巢中的阳性表达主要集中在精巢基部接近中肾处非成熟区的精原细胞和体细胞、生精小叶内的精原细胞以及精巢横切面中部结缔组织的体细胞。5.Wnt4 mRNA在大鲵幼体精巢和卵巢中的表达量分析。实时定量PCR法检测Wnt4 mRNA的表达量由高到低的顺序为:14℃雌鲵>21℃雌鲵>21℃雄鲵>24℃雌鲵>24℃雄鲵>14℃雄鲵。14℃水温组的Wnt4mRNA的表达量在雌鲵和雄鲵之间差异显著(P<0.05),且Wnt4 mRNA在雌鲵中的表达量约为雄鲵的2倍。而对于21℃和24℃两组而言,Wnt4mRNA的表达量在雌鲵和雄鲵之间差异均不显著(P>0.05)。Wnt4mRNA在14℃雌鲵中表达量最高,14℃雄鲵中表达量最低。且在同一水温条件下,Wnt4mRNA在大鲵幼体雌鲵中的表达量始终高于雄鲵。因此,本文认为Wnt4的表达与大鲵幼体卵巢的发育以及功能维持密切相关。6.Wnt4蛋白在大鲵幼体精巢和卵巢中的表达量分析。Western Bolt结果表明Wnt4蛋白表达量由高到低的顺序依次为:14℃雌鲵>14℃雄鲵>21℃雄鲵>24℃雌鲵>21℃雌鲵>24℃雄鲵。同一水温条件下,Wnt4蛋白在14℃、21℃两组大鲵幼体雌鲵和雄鲵之间表达量差异皆为极显著(P<0.01),24℃水温组雌鲵和雄鲵之间表达量差异显著(P<0.05)。同一水温条件下,在14℃、24℃两组中,Wnt4蛋白在雌鲵中的表达量高于雄鲵,但21℃水温组Wnt4蛋白在雄鲵中的表达量要高于雌鲵,且差异极显著(P<0.01)。基于此,本文认为Wnt4的表达不具有性别特异性,Wnt4不仅参与大鲵幼体卵巢的发育过程,同时也是大鲵幼体精巢发育途径中的一部分。7.水温变化对Wnt4表达量的影响。本文的研究表明14℃水温组的大鲵幼体的性腺分化尚未成熟,在该温度条件下Wnt4 mRNA以及Wnt4蛋白在卵巢中的表达量最高。随着水温的升高,大鲵幼体性腺的分化更为成熟,但Wnt4 mRNA以及Wnt4蛋白的表达量均降低,因此,本文推测Wnt4在大鲵幼体卵巢发育的早期发挥更重要的作用。