黄体酮及其代谢产物对创伤性脑损伤后神经保护作用的机制研究研究背景创伤性脑损伤(traumatic brain injury，TBI)致死、致残率高，严重威胁人类的生命与生存质量。TBI后药物性神经保护治疗的匮乏始终是大家关注的焦点。作为神经甾体的一员，黄体酮(progesterone)及其代谢产物对脑、脊髓和周围神经的保护及损伤后修复等研究逐渐引起了人们的兴趣。无论是在TBI还是脑缺血中，黄体酮和它的代谢产物均被证实具有神经保护作用。黄体酮以及其代谢产物在TBI模型中可以明显改善大鼠的认知能力和运动功能，减轻脑水肿并且能够抑制炎症反应，减少神经元死亡。黄体酮在不同的体外实验中可以减少氧自由基损害，发挥脂质过氧化抑制作用，并具有剂量依赖性。一些学者报道，黄体酮及其代谢产物在不同的神经损伤中可以减少凋亡的发生。在大鼠脑损伤后注射黄体酮，结果发现脑组织局部细胞凋亡减少并且caspase-3活性降低。黄体酮的代谢产物别孕烯醇酮(allopregnanolone，ALLO)可以在损伤后减轻TBI大鼠的脑水肿程度，提高神经元存活、改善神经功能恢复。传统观点认为，黄体酮等甾体激素的作用模式是激素分子穿过细胞膜，与靶细胞内的胞浆受体或核受体结合，从而改变靶基因的转录活性。但一些作者发现黄体酮可能通过与黄体酮受体无关的信号转导机制而发挥效应。另一种可能的黄体酮神经保护机制是通过GABA_A受体而发挥其兴奋抑制作用，减少脑损伤中兴奋性毒性所致的细胞死亡。为了研究黄体酮或它的代谢产物是否可以在创伤性脑损伤后发挥神经保护作用，以及其可能的作用机制，我们分别通过制作自由落体损伤TBI动物模型和体外原代培养神经元机械切割伤模型，观察黄体酮以及ALLO的作用，并且检测与损伤后炎症、自由基损伤和凋亡等相关的指标，研究这些神经甾体的可能作用机制。此外，我们还采用黄体酮受体抑制剂米非司酮(mifepristone)来观察黄体酮的神经保护作用是否会因经典的黄体酮受体阻滞而被抑制。第一部分黄体酮对创伤性脑损伤后神经保护作用的机制研究本实验的目的是研究黄体酮是否可以在实验性TBI后发挥神经保护作用，并通过检测与TBI后炎症、自由基损伤、凋亡等相关的指标，研究黄体酮的可能作用机制。本实验还采用特异性黄体酮受体抑制剂米非司酮(mifepristone)观察黄体酮的神经保护作用是否会因细胞内的黄体酮受体阻滞而被抑制。材料和方法成年雄性SD大鼠165只，采用改进的Feeney’s自由落体撞击方法制作重型TBI模型。将大鼠随机分为五组：(1)假手术+HBC注射(SV组)；(2)假手术+黄体酮注射(SP组)；(3)损伤+HBC注射(IV组)；(4)损伤+黄体酮注射(IP组)；(5)损伤+黄体酮+米非司酮注射(IPM组)。黄体酮每次注射剂量为10mg／kg，分别于伤后1h，6h，12h和24h注射。IPM组于损伤前12h接受米非司酮预注射一次，注射剂量为25mg／kg，损伤后每次于黄体酮注射前30min注射米非司酮。各项指标的检查均于致伤后48h进行。采用SP法检测凋亡调节基因Bcl-2和Bax蛋白的表达情况。采用TUNEL染色检测损伤区神经细胞凋亡情况。各组另取5只大鼠，以前囟中心为中心，垂直将脑切成4部分，然后水平切成腹侧和背侧部分。取右后方背侧部分，即是包括损伤区的脑组织。RT-PCR法扩增Bcl-2、bax和GFAP mRNA，测定各组PCR产物密度值与内参照GAPDH的PCR产物密度值，并计算相对表达量。同时，将脑组织置于蛋白提取裂解液中提取总蛋白，western blot法检测Bcl-2、Bax和GFAP三种蛋白的表达情况。另外，我们还采用ELISA法检测损伤区炎症因子TNF-α和IL-1β的含量。采用MDA试剂盒检测损伤区脑组织中TBARS含量；采用黄嘌呤氧化酶法测定局部组织中SOD活性；检测样品中总谷胱甘肽和GSSG的含量，根据测定得到的总谷胱甘肽的含量和GSSG的含量计算出GSH的含量。伤后48h，各组取5只大鼠，通过尾静脉注射伊文氏蓝。1h后断头处死，测定单位质量脑组织中伊文氏蓝的含量。通过干、湿重称量法，计算各组伤后脑组织水含量。根据mNSS评分表，在伤后24h、1周、2周和3周对大鼠运动、感觉、平衡和反射四方面进行评测。结果HE染色发现，在假手术组中，无论是SV组，还是SP组，脑组织光镜下组织结构正常，细胞排列有序。IV组HE染色显示，伤后48h，组织结构紊乱，局部出血、水肿、充血，可见胞核固缩甚至溶解，胞浆内容物减少，伴有细胞坏死、溶解后形成的空泡，创伤区可见炎细胞浸润。而注射黄体酮的IP和IPM组，在伤后48h，亦出现组织结构紊乱，胞核固缩和炎细胞浸润等现象，但较IV组有一定程度的减轻。IP组和IPM组比较，二者损伤程度相似。免疫组化方法显示，Bcl-2蛋白在假手术脑组织中有轻度表达(SV组阳性率为7.19±1.07％；SP组阳性率6.02±1.21％)。损伤后48h其表达水平没有显著变化(6.34±1.21％)。IP组平均阳性率为4.12±1.66％；IPM组平均阳性率为6.28±2.02％，均未能显著改变Bcl-2表达的平均阳性率。Bax蛋白在假手术脑组织中无阳性表达，TBI损伤后48h其表达水平明显升高，达9.65±2.15％。IP组平均阳性率为10.83±2.00％，IPM组平均阳性率为7.32±0.98％，两组与损伤对照组比较均无明显差异。假手术组大鼠脑组织中仅有极少量TUNEL阳性细胞(SV组：1.36±1.03％，SP组：0.44±0.20％)。TBI损伤后48h其阳性率明显升高，为12.21±2.00％。IP组平均阳性率为9.98±1.67％，IPM组平均阳性率为11.23±2.89％，两组与损伤对照组比较均无统计学意义。RT-PCR检测结果显示，假手术组中GFAP mRNA表达水平较低，SV和SP两组比较无显著差异。无论是否注射黄体酮或米非司酮，损伤组的表达均高于假手术组。IV组、IP组和IPM组的GFAP mRNA表达量相近，无统计学差异。Bcl-2 mRNA在各组中的表达差异无统计学意义。假手术组中，SV和SP两组未检测到Bax mRNA表达。损伤后，Bax mRNA的表达水平显著升高。注射黄体酮或米非司酮对这种mRNA水平的升高无影响。通过western blot法检测发现，假手术组中GFAP表达水平较低。无论是否注射黄体酮或米非司酮，损伤组的表达均高于假手术组。IV组、IP组和IPM组的GFAP表达量相近。Bcl-2蛋白在各组中的表达差异无统计学意义。假手术组中，SV和SP两组未检测到Bax表达。损伤后，Bax的表达水平显著升高。注射黄体酮或米非司酮对这种蛋白表达水平的升高无影响。假手术组大鼠脑组织中具有一定浓度的TNF-α表达，损伤后48h损伤区脑组织TNF-α表达水平明显增高。注射黄体酮可以降低其增高的程度，但仍高于正常水平。同时应用米非司酮对黄体酮的这种抑制作用无影响。假手术组大鼠脑组织中具有较低浓度的IL-1β表达，损伤后48h损伤区脑组织IL-1β表达水平明显增高。注射黄体酮可以降低其增高的程度，但仍高于正常水平。同时应用米非司酮对黄体酮的这种抑制作用无影响。假手术组大鼠损伤区脑组织中TBARS含量较低。损伤48h后TBARS含量明显增高。注射黄体酮可以降低其增高的程度，但仍高于正常水平。同时应用米非司酮对黄体酮的这种抑制作用无影响。损伤后脑组织SOD和GSH活性含量明显减低。注射黄体酮可以抑制其减低的程度，但仍低于正常水平。同时应用米非司酮对黄体酮的这种抑制作用无影响。损伤组的脑组织中伊文氏蓝的含量明显高于假手术组。然而，IP组的伊文氏蓝含量与IV组比较无显著性差异。合用米非司酮也不能改变TBI后脑损伤区伊文氏蓝的含量。在损伤灶同侧，各组间病灶周围脑组织水含量比较具有显著性差异。损伤组的病灶周围脑组织水含量高于假手术组，其中IP组的脑组织水含量明显低于IV组，合用米非司酮(IPM组)未能阻断黄体酮的这种抑制作用。假手术组中的SP和SV组大鼠的mNSS评分均为正常(0分)。损伤组中，IP组的mNSS分数在2周和3周时显著低于IV组。结论(1)黄体酮可以对创伤性脑损伤发挥神经保护作用，改善脑损伤区的组织结构形态；(2)黄体酮不能减少创伤性脑损伤后细胞凋亡的数目，也不能影响凋亡相关基因Bcl-2和Bax的表达水平；(3)黄体酮可以降低创伤性脑损伤后炎症因子TNF-α和IL-1β的表达水平，但不能减轻创伤性脑损伤后脑组织GFAP水平的升高；(4)黄体酮可以增高创伤性脑损伤后SOD和GSH的含量，降低脂质过氧化的水平，但不能减轻创伤性脑损伤后血脑屏障的破坏；(5)黄体酮可以减轻创伤性脑损伤后脑水肿的程度，改善创伤性脑损伤后神经功能症状；(6)黄体酮受体拮抗剂米非司酮不能够抑制黄体酮的神经保护作用。第二部分黄体酮及其代谢产物对机械性神经元损伤的保护作用及其机制研究研究背景TBI后的继发性脑损害机制非常复杂，中性粒细胞浸润，神经胶质细胞的活化，血管的病理性反应等诸多因素都会加重脑损伤的程度。以往关于黄体酮对TBI后神经保护作用的研究绝大部分是以啮齿类颅脑损伤模型为基础的。为了进一步研究黄体酮及其代谢产物对单纯神经元损伤是否具有神经保护作用，我们建立了机械切割伤的神经元体外培养模型，观察黄体酮和ALLO对神经元损伤的作用，并通过检测凋亡、自由基损伤等指标，研究其作用机制。材料和方法12h内新生SD乳鼠，取皮层神经元，接种于L-多聚赖氨酸铺底的6孔培养板。培养液为含2％B27的Neurobasal-A Medium。培养第三天加入终浓度为5mg／ml的阿糖胞苷以抑制神经胶质细胞的过度增殖。神经元连续培养10d后行NF-200和GFAP免疫组化染色进行神经元鉴定。原代培养10天后，使用固定有20G针头的自制损伤装置划伤各培养板内培养之神经元。实验分为无损伤对照组(CTRL)、载体对照组(VEH)，损伤组(INJ)、黄体酮组(PROG)和别孕烯醇酮组(ALLO)。CTRL组不行划伤；VEH组不行划伤，每孔培养液中加入1％酒精20μl；INJ组行划伤，伤后30min每孔培养液中加入1％酒精20μl；PROG组行划伤，伤后30min每孔培养液中加入20μl 1mg／ml的黄体酮酒精溶液；ALLO组行划伤，伤后30min每孔培养液中加入0.375mg／ml的ALLO酒精溶液20μl。随后按预定时间点进行检测。除Annexin V-PI双标记流式细胞仪检测在切割伤后24h进行外，其它各指标检测均于损伤后12h进行。用台盼蓝拒染法进行损伤后细胞活性检测。用Hoechst和PI双染色，观察Heochst 33342阳性细胞的细胞核形态，并计数PI阳性细胞占总细胞数。采用LDH检测试剂盒，分别检测各孔培养液上清中和神经元细胞内的LDH含量，计算LDH漏出率。采用MDA试剂盒检测切割伤后神经元细胞内TBARS含量；采用黄嘌呤氧化酶法测定细胞内SOD活性；检测样品中总谷胱甘肽和GSSG的含量，根据测定得到的总谷胱甘肽的含量和GSSG的含量计算出GSH的含量。TRIzol法提取神经元总RNA。两步法RT-PCR检测Bcl-2和Bax mRNA的含量。同时应用Western blot法检测bcl-2和bax蛋白表达的水平。切割伤24h后，CTRL、INJ和PROG组各取一板细胞做Annexin V-FITC-PI流式细胞仪凋亡检测。结果大鼠脑皮层神经元损伤后，倒置显微镜下观察，伤后即见针头划伤区域神经元胞体及突起结构完全消失，见较多细胞碎屑，损伤区周围神经元突起受损，远隔部位神经元镜下结构无明显改变。随着损伤后时间延长，损伤区周围部分神经元胞质透亮度降低，甚至胞膜破裂，胞体及突起结构崩解，呈碎屑状。在加入黄体酮或ALLO的培养板中，仍可见到损伤对照组的损伤性表现，但程度较INJ组减轻，划伤区周围神经元结构完整性提高。神经元原代培养10天后，NF-200免疫组化染色显示，大部分细胞胞浆染成棕色，细胞阳性率不低于85％。GFAP染色，绝大部分细胞为阴性。证实培养之神经元纯度较高，可应用于下一步实验。机械性切割伤后12h，台盼蓝染色显示，损伤组的细胞存活率下降到55.21±8.17％。加入黄体酮或ALLO可以增高细胞的存活率，其中黄体酮组的存活率为74.17±8.69％，ALLO组的存活率为70.08±11.96％，两者与损伤组比较均有显著差异。切割损伤后伤后12h，LDH漏出率明显升高，达41.13±8.65％，而对照组(CTRL和VEH)的LDH漏出率仅为6.32±1.41％和8.65±2.12％。加入黄体酮使LDH漏出率降低为31.22±5.87％，加入ALLO使LDH漏出率降低为32.87±4.61％，两者与损伤组比较差异均有统计学意义。Hoechst和PI双染检测发现，CTRL和VEH组绝大多数细胞被hoechst 33342标记，表现为细胞核呈均匀、朦胧蓝色，PI阳性标记细胞少见。INJ组于切割伤12h后，划伤区周围出现大量PI阳性标记的死亡细胞，发红色荧光，PI阳性率为25.1±11.2％；hoechst 33342标记阳性的细胞中，出现染色质呈簇状、颗粒大小不一、蓝色高亮的凋亡细胞；在加入黄体酮和ALLO的损伤组中，仍可见到颗粒大小不一、蓝色高亮的凋亡细胞，但PI阳性率分别下降为17.2±8.9％和19.3±7.8％，与INJ组比较差异具有统计学意义。CTRL和VEH组细胞中具有一定水平的的SOD和GSH活性，机械划伤后12h损伤区脑组织SOD和GSH的活性明显减低。培养液中添加黄体酮或ALLO都可以抑制SOD和GSH减低的程度，但仍低于正常水平。CTRL和VEH组神经元细胞内TBARS含量较低。切割伤后12h，TBARS含量明显增高。加入黄体酮或ALLO可以降低其增高的程度，但仍高于正常水平。Bcl-2 mRNA在各组中的表达差异无统计学意义，说明神经元切割伤后12h，Bcl-2 mRNA的表达水平没有发生明显变化，而且其表达水平也未受到黄体酮或ALLO的影响。无损伤对照组中，CTRL和VEH两组未检测到Bax mRNA表达。损伤后，Bax mRNA的表达水平显著升高。培养基中加入黄体酮或ALLO对这种mRNA水平的升高无影响。Western blot检测显示，Bcl-2蛋白在各组中的表达无显著差异。Bax蛋白的表达在各组间差异有统计学意义。损伤后，Bax蛋白的表达水平显著升高。培养液中加入黄体酮或ALLO对这种蛋白表达水平的升高无影响。Annexin V-PI双标凋亡检测发现，对照组绝大部分细胞为FITC和PI阴性。机械切割伤后24h，FITC+／PI+细胞比率上升到31.21±4.45％，FITC+／PI-细胞比率也升高到12.7±3.75％，与CTRL组比较差异显著。应用黄体酮组的FITC+／PI+细胞比率较损伤组显著降低，为24.57±6.43％，但FITC+／PI-细胞比率为14.33±6.44％，与损伤对照组差异无统计学意义。结论(1)体外培养大鼠皮层神经元机械性损伤操作简便，重复性好，能在一定程度上模拟颅脑损伤后神经元损伤机制；(2)黄体酮及其代谢产物ALLO可以减少神经元机械性损伤后LDH漏出，提高细胞存活率；(3)黄体酮以及ALLO不能抑制神经元机械性损伤后凋亡的发生，也不能影响损伤后凋亡相关基因Bcl-2和Bax的转录与表达的变化；(4)黄体酮和ALLO可以增高神经元损伤后SOD和GSH的活性，降低脂质过氧化的水平。