多溴联苯醚对斑马鱼免疫相关基因表达的影响

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随着工业等许多领域的发展,持久性有机污染物对人类健康和环境的损伤也越来越大,其中有些物质随着POPs公约的缔合,而逐渐被取缔,尽管如此,很多国家尤其是亚洲地区由于没有找到合适的取代物而继续使用(如四溴联苯醚);而有些物质由于其独特的优势以及目前对其研究的不透彻而没有列入公约范围内,所以目前仍在继续使用(如十溴联苯醚)。本实验选用的两种物质,四溴联苯醚(BDE-47)和十溴联苯醚(BDE-209)同属于多溴联苯醚,是一种溴化阻燃剂,广泛应用于电子产业、纺织业等。水环境是PBDEs的主要环境归宿之一,研究水体中的PBDEs对水生生物的毒性具有重要意义。本研究首先测定了三种浓度(0.01mg/L、0.1mg/L以及1.0mg/L)BDE-47暴露处理雌、雄斑马鱼3d、7d和14d后,斑马鱼几种抗氧化酶(过氧化氢酶和谷胱甘肽过氧化物酶)的活性变化以及脂质过氧化产物丙二醛的含量变化。结果显示BDE-47处理雌、雄斑马鱼后,其体内的抗氧化酶的活性以及脂质过氧化产物的含量均发生了变化,暴露3d及7d的雌性斑马鱼的CAT活性随浓度的增加而升高,暴露14d,CAT的活性随浓度的增加而逐渐下降,雄性斑马鱼暴露于BDE-473d CAT的活性逐渐升高,7d及14d则呈现随浓度增加先上升后下降的趋势;雌性斑马鱼暴露于BDE-473d后GPx的活性呈现增加趋势,但暴露7d及14d的实验组GPx的活性虽然增加但却低于空白对照组,雄性斑马鱼暴露处理后3d及14d GPx的活性呈现先下降后上升的趋势,暴露7d却是逐渐下降的;雌性斑马鱼暴露处理3d MDA的量逐渐增加,7d则表现为先上升后下降,到14d时,MDA的量逐渐降低,雄性斑马鱼的MDA的量则是升高的。说明BDE-47对斑马鱼产生了氧化应激效应。其次,又测定了同样三种浓度(0.01mg/L、0.1mg/L以及1.0mg/L)BDE-209暴露处理雌、雄斑马鱼3d、7d和14d后,雌、雄性斑马鱼体内的抗氧化酶的活性及脂质过氧化产物的含量与对照组相比均产生了变化,雌性斑马鱼暴露处理3d及7d后CAT的活性逐渐降低,而暴露14d则表现为先上升后下降,而雄性斑马鱼暴露处理3d后低浓度实验组CAT的活性最高,之后逐渐下降,处理7d及14d后表现为先升高后降低的趋势;GPx的活性变化及MDA的变化量在两种性别的斑马鱼上均表现出大体一致的趋势,大致趋势为随浓度的增加及时间的延长而逐渐升高。说明BDE-209对斑马鱼产生了氧化应激效应。最后通过表达谱基因芯片技术筛选显著差异表达的基因,对显著差异表达的基因进行GO分析,以及研究与这些显著差异表达的基因相关的信号通路,筛选显著差异表达的免疫相关基因,并对这些免疫相关基因的功能等进行进一步的研究,以及它们参与的信号通路等等。本研究中,0.1mg/L BDE-47实验组中显著差异变化的基因共有4688个,其中免疫相关基因共有37个,其中21个基因上调(差异倍数>3),16个基因下调(差异倍数<0.33);0.01mg/L BDE-209实验组中发生显著差异变化的基因有3836个,其中免疫相关基因数目为32个,其中15个基因发生了上调,17个则发生了下调;而0.1mg/L BDE-209实验组中发生显著差异变化的基因数目为4786个,其中免疫相关基因总共有29个,其中上调的基因数为10个,下调的基因数目是19个。GO分析结果表明差异变化基因参与了多种分子功能和生物过程,0.1mg/L BDE-47实验组中转运活性、抗氧化剂活性、催化活性及酶调节活性的表达变化居前列,0.01mg/L BDE-209实验组中电子载体活性、催化酶活性及结合的表达变化居前三位,0.1mg/L BDE-209实验组中催化酶活性、转运活性及电子载体活性的变化大。三个实验组中参与的生物过程分别包括生殖过程、免疫系统过程、代谢过程、发育过程、应激反应、生物调控以及对生化过程的正负调控等、生殖、生殖过程、生物过程正调控、生长、运动迁移、解剖结构形成以及免疫系统过程等以及生殖、生殖过程、多生物组织过程、生物过程的正调控、运动迁移、节律运动、生长及免疫系统过程等,但每个实验组中生殖及生殖过程的变化都是最高的,我们推测可能通过影响斑马鱼生殖相关基因的表达而对斑马鱼的生殖造成影响。另外,通过对三个组的免疫变化基因的功能及信号通路进行分析,我们得知,三个实验组免疫基因分别参与了12个、7个和12个信号通路,0.1mg/L BDE-47实验组主要有p53信号通路、磷酸肌醇代谢、磷脂酰肌醇信号通路、JaK-STAT信号通路、TGF-beta信号通路、自噬的调节、氨基酸代谢、卟啉等代谢、嘌呤代谢、细胞凋亡、ABC转运以及基底转录因子等,0.01mg/L BDE-209实验组中有JaK-STAT信号通路、TGF-beta信号通路、自噬的调节、嘌呤代谢、MAPK信号通路、细胞凋亡及基底转录因子,0.1mg/L BDE-209实验组主要有p53信号通路、磷酸肌醇代谢、磷脂酰肌醇信号通路、JaK-STAT信号通路、TGF-beta信号通路、自噬的调节、氨基酸代谢、卟啉等代谢、MAPK信号通路、细胞凋亡、错配修复以及基底转录因子等。参与信号通路的免疫基因可能通过这些信号通路来影响斑马鱼对多溴联苯醚的免疫反应,通过本实验的研究,我们推测多溴联苯醚可能会促进细胞凋亡,减弱机体对免疫的反应。为了验证基因芯片的结果的准确性,我们筛选了十个显著差异表达的基因进行Real-time PCR,这十个基因分别是mmp13、 ifng1-2、 cxcl12b、 tnfsf10l4、 bmp15、dnd、gpt2、 fbxo5、 melk、 oep,结果显示大部分基因的变化趋势与表达谱基因芯片结果大体一致,说明本实验表达谱基因芯片数据结果可靠。
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