研究背景：高强度聚焦超声（high intensity focused ultrasound，HIFU）是近年来国内外兴起的非侵入性肿瘤治疗新技术，大量的实验和临床研究都显示HIFU在临床应用有较好的潜力。研究表明，超声损伤组织和细胞的主要机制是机械效应、热效应和空化效应，超声波的空化效应和热效应所引起的生物效应，可以改变细胞膜的脂质双分子层结构，增加细胞膜的流动性和通透性，甚至导致细胞膜破裂，损伤DNA和其他结构，抑制细胞增殖，诱导细胞凋亡，增加化疗药物对细胞的毒性。然而HIFU只适应于肿块边界明确的病变，当肿瘤细胞位于胸水或腹水中时，或肿瘤细胞弥漫浸润时，聚焦超声由于无法确定聚焦靶点而难以杀净其中的癌细胞。我们采用非聚焦超声（Non-Focused Ultrasound，NFU）来解决这一问题，目前国内外尚未见文献探讨这一问题。但是非聚焦超声的作用强度有限。单纯提高超声的剂量，会增加非聚焦超声对组织的弥漫损伤作用，能否通过增加肿瘤细胞对超声的敏感性来解决这一问题呢?我们对这一问题进行了探讨。辐射增敏剂烟酰胺可增加癌细胞对射线的敏感性及阻碍癌细胞DNA损伤后的修复。如果我们用烟酰胺的这一特性来将其作为超声杀伤癌细胞的增敏剂，则不仅能够增加癌细胞对超声的敏感性，而且当超声损伤癌细胞DNA后，烟酰胺可以进一步阻止癌细胞DNA修复，与超声产生协同作用，从而增强超声杀灭癌细胞的作用，产生增敏效果。这一增敏作用不但有可能提高超声灭杀癌细胞的效果，也可使小剂量超声治疗恶性肿瘤成为可能，并减少对正常组织的损伤。因此能否将烟酰胺作为增强超声杀伤癌细胞的增敏剂呢?国内外尚未见相应研究报道。目的和意义：本课题旨在探讨烟酰胺是否能够提高癌细胞对超声波杀伤的敏感性，从而提高非聚焦超声灭杀癌细胞的能力，达到杀灭组织中，特别是胸水和腹水中弥漫分布的癌细胞的目的。在此基础上进一步探讨其增敏原理，为基于烟酰胺增敏的肺癌治疗奠定基础。材料与方法：一、非聚焦超声对悬液中人GLC-82肺腺癌细胞杀伤的实验研究实验分组：1、剂量分组：实验分为五组，非聚焦超声的作用强度分别为0 W／cm²、20W／cm2^、30W／cm²、40W／cm²、50W／cm²五个不同剂量，作用时间均为5 s。2、作用时间分组：实验分为五组，非聚焦超声的作用时间分别为0 s、5 s、10 s、15 s、20 s五个不同作用时间，作用强度均为20 W／cm²。实验方法：台盼蓝拒染法测NFU辐照GLC-82肺腺癌细胞后细胞的即刻存活率；MTT法检测NFU作用后24 h细胞的存活率；流式细胞仪检测细胞周期和凋亡率。二、烟酰胺对人GLC-82肺腺癌细胞体外作用的实验研究实验分为A、B、C、D、E、F六组，其中A组为未加烟酰胺的正常细胞；B、C、D、E、F组烟酰胺的浓度分别为1 mg／ml、2 mg／ml、3 mg／ml、4 mg／ml、5 mg／ml五个不同剂量。实验方法：荧光显微镜观察细胞形态的变化；MTT法检测不同浓度烟酰胺培养细胞后细胞的存活率；划痕试验检测不同浓度的烟酰胺对细胞愈合力的影响；流式细胞仪检测细胞周期和凋亡率。三、烟酰胺对非聚焦超声杀伤GLC-82肺腺癌细胞增敏作用的实验研究实验分为Control、NA、NFU和NFU-NA四组，Control组（空白对照组）：不含烟酰胺不做任何处理，为正常培养GLC-82细胞；NA组（单纯烟酰胺组）：烟酰胺浓度为3 mg／ml；NFU组（单纯超声组）：不含烟酰胺，NFU剂量为30 W／cm²×5S；NFU-NA组（非聚焦超声烟酰胺增敏组）：NFU（30 W／cm²×5 S）辐照前30 min给于3 mg／ml的NA。实验方法：MTT法检测细胞存活分数；荧光显微镜观察细胞形态变化；克隆形成实验检测细胞集落形成能力；核仁组成区染色分析细胞核仁组成区的变化；扫描电镜观察GLC-82细胞表面超微结构的变化；流式细胞仪检测细胞周期和凋亡率。实验结果一、非聚焦超声对悬液中人GLC-82肺腺癌细胞杀伤的实验研究1、GLC-82细胞的即刻存活率随着非聚焦超声功率和作用时间的不断增加而明显下降；2、经非聚焦超声作用后，镜下可见大量的细胞碎片和类焦化物质及死亡的细胞，且随NFU作用时间和剂量的增加而增多，部分细胞出现漂浮现象；3、超声辐照24 h后，随着超声辐照时间和剂量的不断增加，细胞的存活率明显下降，不同作用时间组之间、不同剂量组之间细胞的存活率差异均有显著性（P＜0.05）；4、单纯NFU超声组细胞的凋亡率均明显高于空白对照组，其中30W／cm²组细胞的即刻和24 h凋亡率最高。二、烟酰胺对人GLC-82肺腺癌细胞体外作用的实验研究1、烟酰胺诱导细胞凋亡程度与用药剂量呈正相关，当烟酰胺的浓度小于3mg／ml时对GLC-82细胞凋亡率的影响不大，而4mg／ml和5mg／ml时细胞的凋亡率明显升高，凋亡的细胞呈现边界不清，体积缩小，核固缩，染色质凝集、边缘化，甚至细胞发生破碎，凋亡小体形成；2、烟酰胺对细胞的抑制作用与药物浓度呈正相关，24h时烟酰胺对细胞的半数抑制剂量IC₅₀最高；3、随着烟酰胺浓度的增高GLC-82细胞向划痕区的愈合速度不断减慢，80h时空白对照组划痕区细胞基本上长满（97.28％），1mg／ml-3mg／ml组划痕区均出现不同程度的变窄，而4mg／ml和5mg／ml组细胞划痕区不但没有变窄反而增宽，同时镜下可见部分细胞坏死脱落，细胞间隙增宽；4、烟酰胺的浓度大于等于3mg／ml时，细胞周期主要表现为G₁期比例的上升伴随S期比例的下降。三、烟酰胺对非聚焦超声杀伤GLC-82肺腺癌细胞增敏作用的实验研究1、随着浓度的增加，烟酰胺对非聚焦超声的增敏作用则不断升高，当浓度为3mg／ml、4mg／ml和5mg／ml时其增敏比明显增高，分别为1.765、2.108和2.352；2、NFU-NA增敏组细胞的克隆形成率为2.2％，明显小于空白对照、非聚焦超声及烟酰胺单独作用组；3、荧光显微镜下，NFU-NA增敏组作用24h后GLC-82细胞形态改变：染色质凝集、核固缩，荧光强度增强，凋亡小体形成；4、扫描电镜下，NFU-NA增敏组细胞发生皱缩变圆，表面的微绒毛和丝状结构明显减少；5、NFU-NA增敏组细胞的核分裂象比例明显低于空白对照、NFU及NA单独作用组，而核固缩及核碎裂显著高于其他3组；6、NFU-NA增敏组细胞核的AgNORs无论从数量上还是从形态分布上均出现较明显的变化：细胞核内AgNORs颗粒数目减少，明显低于空白对照、NFU及NA单独作用组；7、NFU-NA增敏组GLC-82细胞的凋亡指数高于空白对照、烟酰胺及超声单独作用组，表现为S期和G2期比例的上升。结论：一、非聚焦超声能杀伤悬液中人GLC-82肺腺癌细胞并抑制其增殖；较低功率的非聚焦超声作用后细胞以凋亡为主要改变，较高功率时则以直接灭杀癌细胞为主；二、随着烟酰胺浓度的增加，GLC-82肺腺癌细胞的存活率呈下降趋势，凋亡率则呈上升趋势；当浓度达到或大于3mg／ml时，则细胞周期阻滞于G1期，细胞的增殖受到抑制；三、烟酰胺可以增强非聚焦超声对悬液中GLC-82人肺癌细胞的灭杀作用，提高非聚焦超声的灭杀效果，对非聚焦超声灭杀癌细胞具有增敏作用。