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次生代谢产物是生物活性物质和药物先导化合物的重要源泉,在人类健康生活中扮演着重要角色。感染性疾病、癌症和高血压等重大健康问题严重影响人类生活,迫切需要开发新的药物用于治疗。土壤中丰富多样的放线菌,因其进化独特、物种多样和次生代谢产物的多样已成为药物开发的重要资源。土壤放线菌在与其他微生物、动物和植物的相互作用过程中,进化产生了结构新颖的次生代谢产物,这些次生代谢物大部分具有抗感染、抗肿瘤、抗病毒、降血脂等广泛的生物学作用,具有潜在的治疗疾病功能,是发现药物先导化合物的重要微生物资源。然而从放线菌中分离可用于治疗各种疾病的新型药物先导化合物仍然存在很多问题,大量的重复性实验过程使得从放线菌中分离得到新次生代谢产物的概率不断降低。尝试生物活性检测指导下的选择性分离技术和利用UPLC-Q-TOF-MS的去重复化技术及决速鉴定技术有望能够有效提高从土壤放线菌中开发新的药物先导化合的效率。为了从放线菌中获得新的生物活性化合物,本研究首先对放线菌发酵液进行抗微生物活性筛选。从采自安徽耕作地、沙土、煤矿土、盐碱地、沼泽地的土壤样品中共分离得到1280株放线菌。采用96孔板法,以耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)、耐万古霉素肠球菌(VRE)、大肠杆菌、白色念珠菌为供试菌,对分离出的1280株放线菌的发酵液进行抗菌活性测定。结果显示,61株放线菌具有抗微生物活性,其中15株对大肠杆菌有较强的抑制活性,13株对白色念珠菌有较强的抑制活性,9株对VRE有较强的抑制活性,9株对MRSA有较强的抑制活性。根据抑菌活性,选择9株抗菌活性较好的放线菌对其发酵产物的化学组成及化学结构进行研究。因为MRSA是严重威胁人类健康的多重耐药性病原菌,所以选择3株对MRSA有较强抑制活性的菌株系统地研究其发酵产物的化学组成及结构(HCCB11494,HCCB11495,HCCB11402);因为多重耐药的革兰氏阴性病原菌已经成为全球公共健康最大的威胁之一,所以选择5株对E.coli有较强抑制活性的菌株系统地研究其发酵产物的化学组成及结构(HCCB11835,HCCB11876,HCCB12080,HCCB12384,HCCB10836);因为能有效治疗真菌感染疾病的药物很少,所以选择1株HCCB11343对白色念珠菌有较强抑制活性的菌株系统地研究其发酵产物的化学组成及结构。因此,在生物活性筛选的指导下,利用UPLC-Q-TOF-MS的去重复化技术及快速鉴定技术快速地分析这些放线菌发酵液的化学组成,快速检测出已知化合物,避免了大量的重复性分离过程。同时通过分析16SrRNA基因序列和构建系统发育树,鉴定出9株菌都属于链霉菌属(Streptomyces)。UPLC-Q-TOF-MS具有快速、高通量、高灵敏度和特异性强的特点,适用于发酵产物中已知化合物的早期识别和去重复。在生物活性检测指导下,利用UPLC-Q-TOF-MS技术,通过一级分子离子峰扫描,检测出发酵液中的主要化学成分,然后在ESI离子源模式下进行二级质谱扫描,归纳出裂解规律,鉴定出化合物的结构。结合文献调研,数据库搜索比对,利用UPLC-Q-TOF-MS的去重复化技术及快速鉴定技术从4株放线菌发酵产物中快速鉴定了 19个已知化合物。结果显示:HCCB11494主要产生 Macrotetrolides 类化合物,其中包括 nonactin,monactin,dinactin,trinactin,tetranactin,Macrotetrolide C 和 Macrotetrolide B;HCCB11495 主要产生香豆素类化合物,其中包括novobiocin,TPU 0031B;HCCB11835主要产生衣霉素类化合物,其中包括 Tunicamycin B2,Tunicamycin B3,Tunicamycin C1,Tunicamycin D1,Tunicamycin D2;HCCB11876主要产生醌霉素类化合物,其中包括7-S-Oxide-Quinomycin A,Qunomycin A,Qunomycin B,Qunomycin C 和 Qunomycin E.在生物活性筛选和化学筛选的指导下,选出五株具有丰富生物活性物质的菌株进一步研究其活性产物。综合分析生物活性筛选与质谱鉴定结果,选择性地从发酵产物中分离制备生物活性化合物,并进行结构鉴定。分别对五株放线菌进行大量发酵,各获得60 L发酵液,然后利用硅胶柱层析、凝胶柱色谱以及HPLC等分离手段对积累的发酵提取物进行化合物的分离纯化,共获得20个单体化合物。综合利用质谱(MS)、比旋光(OR)、紫外光谱(UV)、红外光谱(IR)、核磁(1HNMR,13C NMR,DEPT,COSY,HMQC,HMBC,NOESY)、圆二色谱(CD)、X-ray单晶衍射等鉴定技术确定化合物的结构。其中,6个化合物为新结构化合物,包括4个多烯大环内酯类化合物:15-glycidyl-filipin III(2),16α,17α-epoxy-filipin V(3),16β,17β-epoxy-filipin V(),25β,26β-epoxy-filipin V(5);1 个非蛋白质氨基酸 6-(2-carbonyl-hydroxymethyl-1H-pyrrol-1-yl)-L-norleucine(7)和 1 个环肽类化合物 cyclo-(Leu-Pro-Phe-Pro)(10)。进一步对获得的所有单体化合物的抗菌活性和细胞毒性进行了评价,发现这些化合物具有不同的生物活性。其中新化合物1-5能抑制白色念珠菌的生长,最低抑制浓度分别为6.25、6.25、100、100和100 μg/mL,新化合物也能抑制拟南芥的生长,其IC50 分别为 32.78、16.36、16.36、52.37、67.63 和 54.48 μg/mL;新化合物 10(cyclo-(Leu-Pro-Phe-Pro))对金黄色葡萄球菌有较强的抑制作用,最小抑制浓度为2.5μg/mL;化合物 6(6-(2-carbonyl-hydroxymethyl-1H-pyrrol-1-yl)-L-norleucine),化合物 19(Chartreusin)和化合物 20(3’’-dimethyl-chartreusin)对拟南芥生长有抑制作用,其IC50分别为32.13、37.92和36.21μg/mL。本研究说明,通过生物活性检测指导下的选择性分离技术,结合UPLC-Q-TOF-MS的去重复化技术及快速鉴定技术,可以从土壤放线菌中有效筛选到具有生物活性的新化合物。