微生物是生物降解酶系的主要来源,其中聚糖水解酶系是生物质降解的主力,在生物质废料降解和资源化利用中具有应用前景。研究表明细菌和真菌来源的聚糖降解酶系在多样性和酶活稳定性等特征上差别较大。相对于真菌酶系,细菌型酶系种类更多,有更宽的pH和温度适应范围。另外细菌生长快,对发酵设备等条件的要求相对较低,因而具有降低工业成本的优势。本研究从采自印度尼西亚巴淡岛热带森林蚁丘土壤样品中分离到一株能同时降解羧甲基纤维素钠(CMC-Na)、木聚糖、甘露聚糖和地衣多糖的芽孢杆菌菌株HS81。根据表型特征和16S rRNA基因序列分析,初步鉴定其为枯草芽孢杆菌spizizenii亚种成员。本研究揭示了该菌株生长速度和酶解活力均显著高于spizizenii亚种参比菌株Bss6和其它供试菌株。然而,目前还没有关于该亚种菌株聚糖水解酶系基因功能和酶学特性的研究报道。所以本研究进一步以此特殊菌株为材料,旨在探索从热带蚁丘分离的芽孢杆菌中克隆特别的聚糖水解酶系基因,并进行表达、功能验证和酶学性质研究。在本项目开始时,由于没有近似种菌株基因组序列的报道,我们根据芽孢杆菌种、属相关酶序列设计保守引物或简并引物,通过PCR克隆法成功地从HS81基因组中分离了内切β-1,4-葡聚糖酶(CelB1n)、内切β-1,4-甘露糖苷酶(manB1n)、内切β-1,3-1,4-葡聚糖酶(gluBn)和内切β-1,4-木糖苷酶(XylB1n)基因;并将各基因通过细菌表达系统pET26b(+)在大肠杆菌中实现了高效表达和功能验证。平板验证实验表明,和参比菌粗酶液相比,各重组菌粗酶液在同样条件下对特异底物的降解圈显著增大。DNS法酶活测定实验表明四种聚糖酶工程酶均具有高比活(2409.67-104132.55 U/mg)。最适温度为55-80℃,并在50-60℃具有较好的稳定性;最适pH为5.0-6.0,并在pH 5.0-10.0具有很好的稳定性(>80%)。各表达酶对大部分测试的金属离子和化学试剂具有较好的抗性。甘露糖苷酶活性最稳定,其最适反应温度为80℃,并在80℃和90℃下保温90min后,其剩余酶活分别为92.7%和78.6%,而且在100℃保温60 min后,仍具有81.3%的剩余酶活。表明该甘露糖苷酶manB1n是一种极端嗜热酶,在100℃高温下仍具有较高的酶活稳定性。序列分析表明分离自热带蚁丘的菌株HS81其上述四种聚糖酶基因序列和参比菌株均有一定差异,表现出一定的酶结构多样性,这也可能与菌株的特殊来源有关。另外,pET26b(+)表达系统和镍离子亲和层析柱纯化效率也对于各重组酶的高活性有贡献。综上所述,克隆菌株HS81的四种聚糖酶基因具有重要应用价值,各工程酶均为耐热、耐碱、高活性,在农林废弃物处理、纸浆漂白、洗涤剂和纺织工业中具有潜在应用价值。