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Ⅰ文献研究通过回顾祖国医学有关膝骨关节炎的研究现状综述,认识到其中医病机是肝肾亏虚为本,血脉不利为标;其治则为补益肝肾,益气行血。临床相关报道疗效显著,但对其作用机理知之甚少。现代医学认为,膝骨关节炎发病原因主要是由于各种因素导致软骨中的软骨细胞的去分化及其分泌的基质的合成和分解代谢紊乱所致。关节康是导师根据上述膝骨关节炎的病机及治则研制的经验方。为了证实补肾活血法(关节康)治疗膝骨关节炎的疗效和探讨其作用机理,我们设计这一实验方案。Ⅱ临床研究1目的:通过临床对比观察补肾活血中药(关节康)及结合关节镜技术治疗膝骨性关节炎的临床疗效,得出补肾活血中药(关节康)及结合关节镜对膝骨关节炎搭配治疗的防治效果和适用特点。2方法:通过临床中、西医诊断标准筛选后的肝肾亏虚,血脉不利型膝骨关节炎患者46例进行随机分组为关节康组及关节康+关节镜组,观察疗程分别为4周,12周,36周,参照膝关节骨性关节炎病情分级标准通过对患者疼痛症状,日常活动功能障碍及总计分进行进行问卷评分;所有数据采用自身前后配对T检验,运用SPSS 11.0版统计软件包对数据资料进行统计学处理。3结果:治疗后两组患者疼痛症状平均分值、功能障碍平均分值和总计分平均分值较治疗前显著升高,膝关节临床症状明显减轻,关节功能显著改善。经统计学处理,膝关节日常生活活动评分(疼痛症状平均分值、日常活动功能障碍平均分值和总计分平均分值)治疗后显著高于治疗前(P＜0.05),但关节镜组在术后36周与治疗前对比无显著性差异(P＞0.05)。两组间疗效在治疗后4周,12周无显著性差异(P＞0.05),两组间疗效在治疗后36周后存在显著性差异:疼痛症状平均分值和功能障碍平均分值(P＜0.05),总计分(P＜0.01)。4结论:临床观察中关节镜下清理术对骨性关节炎患者短期内可收到明显的疗效,术后4周开始患者疼痛及功能均有明显改善,但随着随访时间的延长,患者可出现疗效下降的趋势;关节镜手术可以改善病人的关节功能.缓解疼痛,推迟人工关节置换的时间;补肾活血中药(关节康)对骨性关节炎患者短期内疗效并不突出,但随着随访时间的延长,患者可出现疗效上升的趋势;通过补肾活血中药(关节康)配合关节镜手术取长补短,在临床中可取得满意疗效;膝骨关节炎属于难治性疾病,目前的各种单一疗法虽有效,但总有其局限性。通过补肾活血中药(关节康)配合关节镜手术进行内外中西结合综合治疗方法将逐渐成为中西医结合治疗本病的主流。Ⅲ实验研究11目的:观察体外经传代培养去分化的关节软骨细胞,经补肾活血中药(关节康)血清培养后生物学性状及功能的变化,探索去分化软骨细胞再分化的手段,为软骨细胞组织工程种子细胞建立合适的体外培养方法。2方法:无菌条件下取兔关节软骨组织,酶消化法分离软骨细胞,分成两组:一组对照组常规单层传代培养,另一组为实验组,单纯常规培养3代后添加补肾活血中药(关节康)血清,继续培养2周。观察对照各组细胞形态,细胞爬片后进行阿利新蓝染色及Ⅱ型胶原免疫组织化学检测,观察细胞表型变化。3结果:兔关节软骨细胞体外培养3代后迅速去分化,增殖缓慢。添加补肾活血中药(关节康)血清后去分化速度明显减缓,血清混合培养2周后,细胞外形恢复良好,阿利新蓝染色阳性及Ⅱ型胶原免疫组织化学检测阳性。4结论:补肾活血中药(关节康)血清与软骨细胞的混合培养,能延缓软骨细胞的去分化,并可以促进去分化后的软骨细胞再分化,分泌Ⅱ胶原及糖蛋白,保持软骨细胞的形态和功能,有望用于在体外培养时防止软骨细胞的去分化及促进去分化软骨细胞的再分化。Ⅳ实验研究21目的:应用干细胞定向分化技术,将脂肪组织来源干细胞定向分化为脂肪细胞、成骨细胞、软骨细胞并进行鉴定,为软骨组织工程获取大量种子细胞做准备。2方法:通过患者抽脂术后自愿捐献的成人脂质部分进行分离培养,传代,应用四唑盐XTT法测定细胞活性并描绘细胞增殖曲线,应用流式细胞表面抗原分析进行干细胞标记鉴定,将第四代的脂肪来源干细胞向成熟脂肪细胞、成骨细胞及软骨细胞定向诱导分化并进行油红0鉴定、茜素红染色定性及阿新兰染色鉴定;并将成软骨方向诱导后的脂肪来源干细胞进行免疫组化检测Ⅱ型胶原的表达3结果:脂肪来源干细胞体外增殖速度快,传代培养可获得大量有分化能力的细胞,平均倍增时间为50小时,并且保持稳定的倍增率直至13～15代,其中衰老和死亡细胞所占比例也很少,通过流式细胞表面抗原分析细胞表型CD29阳性,CD44阳性,说明该细胞具有干细胞特性,通过定向分化技术,脂肪来源干细胞可向脂肪细胞、成骨细胞及软骨细胞分化并经油红0鉴定、茜素红染色定性、阿新兰染色鉴定,进一步说明其干细胞特性,经定向分化后的软骨细胞通过免疫组化检测Ⅱ型胶原的表达阳性,说明定向分化后的细胞具备正常软骨细胞的功能。4结论:本研究的结果再次证实了软骨细胞的“去分化”现象;我们成功地实现了ASCs向脂肪细胞、成骨细胞,软骨细胞的定向分化,分化后的细胞经油红0,茜素红及阿新兰染色鉴定且证实;在特定的环境,诱导脂肪来源干细胞向软骨细胞定向分化,以向软骨方向分化后的脂肪来源干细胞作为软骨组织工程的种子细胞,可能具有比单纯的软骨细胞更好的效果,为软骨组织工程提供了可靠的种子细胞。