研究背景肾母细胞瘤是小儿泌尿外科最常见的恶性肾脏肿瘤,约占95%,其发病率约为1/10000,肿瘤的恶性度高,生长速度较快,易发生转移。虽然目前通过手术切除联合术后化疗和放疗等综合治疗途径,可使肾母细胞瘤患儿的5年生存率得到显著提高,但肾母细胞瘤的治疗仍面临诸多问题,如多重耐药现象的克服、化疗毒副作用的降低和治疗有效率的提高等,而且对肾母细胞瘤的发病机制和转移机制的认识尚不充分,也缺乏相应有效的靶向治疗。因此,寻找肾母细胞瘤预后的特异性预测因子以及治疗靶点迫在眉睫。近年来,脂质代谢在肿瘤中的作用越来越受到关注,调节脂质代谢在肿瘤的治疗中具有重要的临床价值。由于肿瘤细胞的高代谢特性以及在化放疗中的营养缺乏,脂肪酸代谢往往可以为肿瘤细胞提供必要的能量;脂肪酸是磷脂的基本合成成分,而磷脂则是细胞膜重要的结构分子,因此,当肿瘤细胞快速增殖时需要大量的脂肪酸。除此之外。脂肪酸在多种促癌信号分子的合成中起到了重要的作用,其中包括前列腺素、溶血磷脂酸和磷酸肌醇。近年来有研究表明,在多种恶性肿瘤如胃癌、肺癌、膀胱癌、前列腺癌中观察到脂肪酸代谢途径中的关键基因ATP-柠檬酸裂解酶、乙酰辅酶A羧化酶、脂肪酸合成酶和酰基-辅酶A去饱和酶的活性和表达的提高,而且与肿瘤患者的不良预后相关。通过干预这些代谢酶的表达或靶向特异性抑制剂的应用可以抑制代谢酶活性或表达,从而可起到抑制肿瘤细胞的生长的作用。脂肪酸合酶(Fatty acid synthase,FASN)是脂肪酸合成途径和细胞底物能量代谢的关键酶,在乙酰辅酶A、丙二酰辅酶A和NADPH合成长链脂肪酸的过程中起到关键作用。FASN是由两个相同的272kDa多功能多肽组成的完整酶系统。在多数非脂肪组织中,FASN的表达与活性在很大程度上会受到摄入足够膳食脂肪的抑制,但在多种人类癌症,如卵巢癌、前列腺癌、结肠癌、膀胱癌中异常升高并且与肿瘤预后不良有关。靶向FASN的治疗在肿瘤中的研究也越来越受到关注,在结肠癌中,通过干扰FASN的表达,可以调节AKT、JNK等相关细胞通路,抑制肿瘤细胞的增殖、迁移及侵袭。在膀胱肿瘤中,抑制PKM2后,间接引起FASN的表达降低,并通过AKT/mTOR信号通路,起到治疗肿瘤的目的。人轻辅酶 A 脱氢酶 α(Hydroxyacyl-CoA Dehydrogenase Trifunctional Multienzyme Complex Subunit Alpha,HADHA)是线粒体三功能蛋白(TFP)的α亚基,其催化长链脂肪酸的线粒体β氧化的最后三个步骤。线粒体TFP由四个α(HADHA)和四个β(HADHB)亚基组成:HADHA负责催化长链3-羟基酰基辅酶A脱氢酶和烯酰辅酶A水合酶活性,而HADHB催化3-酮酰辅酶A硫解酶活性。除了脂肪酸β-氧化外,HADHA还参与其它脂质代谢过程,例如脂质生物合成,酮生成和酮解。研究发现HADHA参与了人类癌症的发病机制、预后和放化疗抗性。HADHA在乳腺癌中的表达下调,尤其是转移性和复发性乳腺癌。与非肿瘤对照组相比,肝细胞癌中HADHA的减少,而且HADHA可能是肺癌化疗对铂类化疗反应的潜在预测指标。最近的研究还发现HADHA参与了miRNA的加工、自噬和细胞凋亡。脂质代谢是否参与了肾母细胞瘤的发生发展目前尚未有相关研究。因此,探讨脂质代谢关键酶在肾母细胞瘤中的作用及调控机制,将有助于进一步阐明肾母细胞瘤的发病机制并为其靶向治疗提供新的思路。材料和方法收集在山东省立医院就诊并手术的20例肾母细胞瘤患儿的肿瘤组织及其瘤旁正常组织(Ⅰ期:10例;Ⅱ期:7例;Ⅲ期:3例);选取其中9例(Ⅰ期:3例;Ⅱ期:3例;Ⅲ期:3例)进行Label-free检测肿瘤组织及瘤旁正常组织中差异表达蛋白;STRING数据库分析差异蛋白的相互作用关系;IPA对质谱数据进行综合分析;GO/KEGG富集分析寻找差异蛋白的功能;运用DAVID数据库进行蛋白质功能分类筛选,筛选出脂质代谢相关蛋白;KEGG分析其参与的重要信号通路过程;对脂质代谢蛋白进行分类确定进一步研究的蛋白。选取上述20例肿瘤与瘤旁组织:Oncomine癌基因数据库检索及qRT-PCR从基因层面验证FASN及HADHA的表达;通过Western blotting、免疫组化、免疫荧光检测,验证肿瘤与瘤旁FASN及HADHA蛋白的差异性表达;另外收集2007年1月到2012年1月在山东省立医院就诊并手术的肾母细胞瘤患儿石蜡标本65例(Ⅰ期:32例;Ⅱ期:21例;Ⅲ期:12例),分析临床病理参数/组织病理分型与FASN、HADHA表达的关系;Kaplan-Meier生存曲线分析FASN、HADHA的表达与患儿预后的关系。选取SK-NEP-1细胞株,比较FASN、HADHA在SK-NEP-1细胞与293T细胞中表达差异;慢病毒干扰SK-NEP-1细胞中FASN、HAHDA的表达,qRT-PCR检测细胞转染效率;CCK-8以及Western blotting检测转染后各组细胞的增殖变化;Western blotting 检测 FASN、p-AKT、AKT、P62、Beclin-1、LC3、cleaved-caspase-3、pro-caspase-3、cleaved-parp-1、vemintin、E-钙粘连蛋白、N-钙粘连蛋白的表达;流式细胞仪、AO-EB检测细胞凋亡及自噬性死亡的情况,并使用3-MA抑制自噬后验证是否存在自噬性死亡。Transwell细胞迁移/侵袭实验检测细胞迁移/侵袭能力的变化。验证HADHA干扰后细胞对长春新碱化疗敏感性的变化。结果一、肾母细胞瘤肿瘤中脂质代谢蛋白组学分析Label-free法质谱检测结果表明:与对应的瘤旁正常组织相比,肾母细胞瘤组织中有437种差异表达蛋白,其中219种蛋白高表达,218种蛋白存在低表达,差异存在统计学意义(P<0.05)。将437种蛋白质于STRING数据库中,其中418种蛋白质之间存在相互关系。GO/KEGG富集分析发现,差异表达蛋白存在于各种细胞生物学行为中,如线粒体失功能、代谢途径、细胞死亡和乙酰化修饰等。DAVID蛋白质功能分析得出,与脂质代谢相关的蛋白总共有19个,上调的蛋白有FASN、ISYNA1、ALOX15;下调的蛋白是HADHB、ACAA1、ACAA2、CPT1A、ECHS1、ACSF2、、EHHADH、PC、、ACADM、、ACADSB、、ECH11、GM2A、DECR11、HADHA、NDUFAB11、H3F3A。IPA分析可以发现肾母细胞瘤肿瘤中的蛋白代谢与肿瘤、细胞的死亡、细胞周期以及脂质代谢等密切相关。脂质代谢在肿瘤中占据着重要的位置;而且信号通路分析发现,失调蛋白在脂肪酸代谢通路中起到了重要的作用,且与多条肿瘤的经典通路相关,参与了肿瘤的凋亡与自噬;而且从调控子效应网络可以看到:FASN位于总调节网络的重要位置参与了包括细胞迁移、细胞增殖以及肿瘤坏死的过程,并与多种信号通路相关。KEGG富集给出了具有最小p值的前20个途径,包括脂肪酸代谢和脂肪酸降解的经典通路。我们发现HADHA位于KEGG信号通路的重要位置并参与了该过程。综上,我们筛选出了肾母细胞瘤中脂质代谢的关键蛋白FASN和HADHA。二、FASN在肾母细胞瘤中的作用及机制研究1.FASN在肾母细胞瘤中高表达,且与患儿临床分期/组织病理以及不良预后相关Label-free法质谱检测结果表明:与对应的瘤旁正常组织相比,肾母细胞瘤组织中FASN高表达。Oncomine数据库检索发现FASN的在肿瘤中的高表达(P=0.005),qRT-PCR进一步验证FASN的表达肿瘤明显高于瘤旁组织(P<0.05);Western blotting、免疫组化、免疫荧光结果表明,肿瘤组织中FASN蛋白的表达明显高于瘤旁组织。临床病理参数分析表明,FASN的高表达与患儿年龄(P=0.083)、性别(P=0.620)、是否有淋巴结转移(P=0.086)无明显相关性;而与组织病理分型(P=0.032)及患儿的临床分期密切相关,且Ⅲ期与Ⅰ期(P=0.001)、Ⅱ期与Ⅰ期(P=0.007)的比较存在统计学差异。通过对65例肾母细胞瘤患儿石蜡标本预后分析发现,FASN的高表达与患儿的不良预后密切相关(P=0.016)。2.下调FASN可以通过抑制AKT信号通路,进而抑制SK-NEP-1的增殖、迁移及侵袭,同时促进其凋亡及自噬性死亡。Western blotting检测结果显示SK-NEP-1中FASN的蛋白表达水平明显高于293T细胞(P<0.05)。在FASN干扰组中CCK-8细胞增殖实验结果表明,SK-NEP-1细胞的增殖能力明显受到抑制(P<0.05),Ki67的表达也明显受到抑制。Western blotting检测凋亡蛋白及自噬相关蛋白的表达:在FASN干扰组cleaved-caspase-3/pro-caspase-3、cleaved-parp-1 的表达明显升高;自噬相关蛋白LC3、Beclin-1的表达增加,P62的表达减低;流式细胞术检测发现早期凋亡细胞与晚期凋亡细胞在转染后明显增多,差异具有统计学意义(P<0.05);吖啶橙/溴化乙啶染色结果同样提示,转染后死亡的细胞明显增多(P<0.05)。使用自嗤抑制剂3-MA后,细胞自噬水平减低,细胞死亡减少,表明在SK-NE-1细胞中敲低FASN的表达后引起的细胞死亡为自噬性死亡。在FASN干扰组中,与上皮-间质转分化相关的E-钙粘连蛋白表达增加,vimentin及N-钙粘连蛋白表达降低(P<0.05);Transwell细胞迁移实验结果表明FASN干扰组中穿过小室的细胞数目明显减少,表明在SK-NE-1细胞中敲低FASN的表达后可抑制肿瘤细胞的迁移。Western blotting检测结果显示FASN干扰组中p-AKT表达明显降低(P<0.05),表明FASN可能通过AKT信号通路调控肾母细胞瘤细胞的生物学行为。三.HADHA在肾母细胞瘤中的作用及在肿瘤化疗中的作用1.HADHA在肾母细胞瘤中低表达,但高表达的患儿恶性程度较高、预后较差Label-free法质谱检测结果表明:与对应的瘤旁正常组织相比,肾母细胞瘤组织中HADHA低表达。qRT-PCR进一步验证肿瘤组织中HADHA mRNA的表达水平明显低于瘤旁组织(P<0.05);Western blotting、免疫组化、免疫荧光检测结果表明,肿瘤组织中HADHA蛋白表达水平明显低于瘤旁组织。临床病理参数分析表明,HADHA的表达与患儿年龄(P=0.137)、性别(P=0.209)、是否有淋巴结转移(P=0.479)无相关性,HADHA的表达与肿瘤分期无相关性(Ⅲ期与Ⅰ期P=0.406;Ⅱ期与Ⅰ期P=0.300),HADHA与组织病理分型(P=0.030)密切相关。65例肾母细胞瘤患儿预后分析显示HADHA高表达与患儿不良预后密切相关(P=0.046)。2.下调HADHA可以通过抑制AKT信号通路,进而抑制SK-NEP-1的增殖,同时促进其凋亡;而自噬水平受到抑制,通过抑制保护性自噬可以增加长春新碱的化疗敏感性。SK-NEP-1中HADHA的蛋白表达水平明显高于293T细胞(P<0.05)。下调HADHA表达后,CCK-8细胞增殖实验结果表明,SK-NEP-1细胞的增殖能力明显受到抑制(P<0.05);Ki67的表达也受到抑制,提示细胞增殖的降低。Western blotting检测发现cleaved-caspase-3/pro-caspase-3、cleaved-parp-1 的表达在HADHA干扰组中明显升高;流式细胞检测发现早期凋亡细胞与晚期凋亡细胞在HADHA干扰组明显增多,差异具有统计学意义(P<0.05)。在HADHA干扰组中自噬相关蛋白LC3、Beclin-1减低,P62增高;使用长春新碱处理SK-NEP-1细胞时,发现了自噬水平的增强,考虑其中可能有保护性自噬的产生,而使用相同浓度的长春新碱处理HADHA干扰组时,发现了HADHA干扰组中自噬水平的相对减低,说明HADHA干扰后的细胞对长春新碱敏感性增加。流式细胞仪检测发现HADHA干扰后,肿瘤细胞的死亡明显增加。因此,考虑下调HADHA的表达可通过抑制保护性自噬从而起到了对长春新碱化疗增敏的作用。Western blotting检测结果显示HADHA干扰组中p-AKT表达明显降低(P<0.05)。表明下调HADHA可以通过抑制AKT信号通路起到调控肾母细胞瘤肿瘤细胞的作用。结论以质谱为基础的非标记定量蛋白质组学提示在肾母细胞瘤肿瘤与瘤旁组织中存在437差异性表达蛋白,其中与脂质代谢相关的蛋白有19种。这些失调蛋白参与了肾母细胞瘤的生成,也有潜力成为肾母细胞瘤的诊断的标记物、预后预测因子和分层治疗的靶点。FASN在肾母细胞瘤肿瘤组织中表达上调,且与患儿临床分期与预后密切相关。下调FASN可以抑制AKT信号通路,进而抑制肾母细胞瘤细胞SK-NEP-1的增殖、迁移及侵袭,同时促进肿瘤细胞的凋亡及自噬性死亡,发挥了癌基因的作用。HADHA在肾母细胞瘤肿瘤组织中表达下调,但其高表达与患儿病理分型及预后密切相关。下调HADHA可以抑制AKT信号通路,进而抑制肾母细胞瘤细胞SK-NEP-1的增殖,促进细胞的凋亡;同时,下调HADHA可以通过抑制保护性自噬,增强SK-NEP-1对长春新碱的化疗耐药性。