沙门氏菌可以通过污染食物感染人和动物,是重要的人兽共患病原之一。在抗生素的选择性压力下,耐药菌株不断出现,特别是多重耐药性(MDR)菌株,这已成为严重的公共卫生问题。多重耐药性沙门氏菌常常同时耐五种抗生素:氨苄青霉素、氯霉素、链霉素、磺胺和四环素(R型:ACSSuT)。这种耐药表型最早出现于上个世纪70年代末,到1995年发现有超过50%的鼠伤寒沙门氏菌带有该耐药表型。在全球范围内沙门氏菌分离株的耐药性似乎都在增强。肠道沙门氏菌的耐药性极度复杂,而且血清型分布广泛。近20年来,世界各地已报道多重耐药性沙门氏菌的分离率越来越高,遍布各个血清型沙门氏菌。本研究的目的旨在收集不同来源沙门氏菌,测定这些分离株对抗生素的敏感性,比较不同来源沙门氏菌耐药表型的差异,探讨沙门氏菌分离株耐药机制,并应用PFGE技术进行分子流行病学分析。1.不同来源沙门氏菌的多重耐药性研究1962~ 2006年从我国江苏、上海、山东、陕西、河南、浙江、新疆、安徽、山西、广西等10个省、市、自治区的病死鸡分离和收集到237个鸡白痢沙门氏菌分离株,肠炎沙门氏菌为4株;2003~2006年从新鲜的鸡肉、猪肉和牛肉中分离到81株沙门氏菌、从饮食行业从业人员肠道排泄物分离到36株沙门氏菌,食物源和人源菌株来自江苏省内4个地区,覆盖18个血清型,分离率最高的沙门氏菌为德尔卑沙门氏菌、肠炎沙门氏菌和阿贡纳沙门氏菌。选取18种常用于沙门氏菌病治疗的抗生素进行药物敏感性试验,抗生素敏感性试验结果表明,117个食物源和人源菌株中有111个分离株对2种或2种以上的抗生素有耐药性,人源沙门氏菌分离株的抗生素耐药率比食物源的高,单一抗生素以链霉素耐药率(92.3%,108/117)最高,其次为甲氧苄氨嘧啶(88%),头孢孟多(57.3%),氨苄青霉素(44%),卡那霉素(40%),四环素(33%),氯霉素(22%)。对5种或5种以上抗生素耐药的分离株有59株(50.4%),其中对特定六种抗生素:氨苄青霉素、氯霉素、链霉素、磺胺、四环素和卡那霉素耐药(R型:ACSSuTK)的菌株有12株。在237株鸡白痢沙门氏菌中,1997年以前的菌株对抗生素的耐药率相对较低,对氯霉素、萘啶酮酸、环丙沙星、卡那霉素和头孢菌素全部敏感,多重耐药菌株出现在1997年以后,耐药表型主要为ASSuTTm和SSuTTmNCf等。1998年沙门氏菌分离株对氨苄青霉素、链霉素、四环素、羧苄青霉素和甲氧苄氨嘧啶等5种药物的耐药达到高峰(耐药率在50%以上)。2000年以后的分离株(61株)耐药率没有1998年分离株对这5种药物的耐药率高,但耐药谱开始复杂化。耐萘啶酮酸菌株出现于2000年以后,耐药率为82%(50/61),同时表现出对环丙沙星敏感性下降。结果显示,食物源和人源菌株的耐药谱比鸡白痢沙门氏菌要广,对氯霉素和卡那霉素耐药的菌株比鸡白痢沙门氏菌要多,但是对单一抗生素如氨苄青霉素、链霉素、四环素等的耐药率和最小抑菌浓度(MIC)没有鸡白痢沙门氏菌高。2.MDR沙门氏菌的耐药基因和Ⅰ类整合子特征根据不同的年代和耐药表型,从237株鸡白痢沙门氏菌中选取60株MDR鸡白痢沙门氏菌;从117个食物源和人源菌株中选取39株不同来源和不同耐药表型的MDR沙门氏菌菌株,分析这些分离株的耐药基因和Ⅰ类整合子。根据GenBank中发表的耐药基因的序列,设计18对耐药基因和Ⅰ类整合子的引物,对99株不同来源和耐药特征的MDR菌株进行耐药基因和Ⅰ类整合子的检测,PCR扩增结果与抗生素敏感性表型一致。鸡白痢沙门氏菌的耐药表型主要为ASSuTTm、SSuTTm、SSuTTmN等,通常携带blatem-1、tetA、sul2、strA-B和dfrA12基因,1997年以前的分离株都不含有Ⅰ类整合子,1998年分离株中出现Ⅰ类整合子阳性菌株;食物源和人源MDR沙门氏菌的耐药表型主要为ACSSuTKTm、CSSuTKTm、CSSuTTmN等,主要有blatem-1、aadA1、blapse1、sul1、sul2、tetA、tetB、tetG、strA-B、floR、cmlA和dfrA12基因,Ⅰ类整合子阳性率为31/39。研究表明食物源和人源MDR沙门氏菌的耐药基因型比鸡白痢沙门氏菌的耐药基因型复杂,前者同一种耐药表型由一种以上耐药基因控制,而鸡白痢沙门氏菌的耐药基因通常只有一种。99株沙门氏菌分离株中有59株细菌携带有Ⅰ类整合子,大小为0.3、0.6、1.0、1.2和1.6 kb,其中1.6kb(aadA5-dfr17)大小的整合子在细菌中分布广泛。接合试验表明,氨苄青霉素、氯霉素、链霉素、甲氧苄氨嘧啶和四环素的耐药特性是由接合性质粒携带。耐药基因多数由Ⅰ类整合子和质粒携带,可以通过接合试验发生转移,可移动的DNA成分可能在耐药特性的转移和分布中起到重要作用。3.沙门氏菌gyrA、acrB、ompF和marA突变对抗生素敏感性的影响沙门氏菌的耐药机制包括靶位的改变、膜通透性下降和外排泵的过量表达,参与这些机制的有外排泵如AcrRAB、和膜孔蛋白如Omp F和Omp C,还有这两个机制的调控子MarRAB。本研究主要分析外排泵基因和外膜蛋白突变以及两者的调节基因marA突变对多重耐药性(包括氟喹诺酮类药物)所起的作用,以及gyrA基因QRDR区突变对氟喹诺酮类药物敏感性的影响。通过微量稀释法测定61株鸡白痢沙门氏菌、117株食源性和人源沙门氏菌对萘啶酮酸和3种氟喹诺酮类药物的敏感性,用PCR方法扩增gyrA基因QRDR并进行测序分析,确定萘啶酮酸耐药性沙门氏菌gyrA基因QRDR区突变情况。用萘啶酮酸MIC为2、256、512和1024μg/mL的沙门氏菌菌株作试验菌株,来分析膜通透性下降和外排泵的过量表达对抗生素敏感性的影响。采用插入突变法构建了marA、acrB和ompF的突变株,分析其对氟喹诺酮类药物和其他抗生素敏感性的影响。食源性和人源沙门氏菌分离株对萘啶酮酸的耐药率39/117,鸡白痢沙门氏菌分离株为50/61。3种氟喹诺酮类药物对萘啶酮酸耐药性沙门氏菌的最小抑菌浓度明显比萘啶酮酸敏感株高。萘啶酮酸耐药性沙门氏菌gyrA基因QRDR的序列分析表明,在食源性和人源沙门氏菌分离株中,所有萘啶酮酸耐药性沙门氏菌gyrA的83或87位点发生了突变,第83位点发生点突变的菌株对萘啶酮酸的MIC范围大于或等于1024μg/mL,而87位点突变的菌株的MIC范围为32~512μg/mL;耐萘啶酮酸的鸡白痢沙门氏菌gyrA都是在83位点发生了突变,对萘啶酮酸的MIC范围512~1024μg/mL。沙门氏菌分离株gyrA发生点突变的位点与萘啶酮酸耐药水平高低存在一定的相关性,且导致对3种氟喹诺酮类药物的敏感性下降。marA、acrB和ompF的突变株表现出对许多抗生素敏感性的敏感性上升,其中acrB突变株对氟喹诺酮类药物敏感性上升8~16倍,对四环素、氯霉素、β-内酰胺类抗生素的敏感性上升2~8倍,而marA和ompF的突变株的敏感性上升2~8倍。结果表明外排泵机制是对沙门氏菌多重耐药性影响较大的因素之一,而gyrA基因突变和外排泵机制是氟喹诺酮类药物产生耐药性主要原因。4.不同来源沙门氏菌脉冲场凝胶电泳分型研究为研究沙门氏菌菌株间的关系,建立了脉冲场凝胶电泳(PFGE)分型方法,对从食品中分离的沙门氏菌和临床样品中鸡白痢沙门氏菌分离株进行了分型研究。在食源性沙门氏菌不同菌株之间的分子流行病学关系方面,脉冲场凝胶电泳是一种有效的方法,菌株间的相似值(F)在0.15~1之间,不同地区之间没有同源的菌株,同一个地区相同血清型沙门氏菌有同源的菌株;而鸡白痢沙门氏菌同一地区不同年份可出现同源菌株,不同地区和不同年份之间的鸡白痢沙门氏菌的相似值在0.6~1。可见PFGE是研究沙门氏菌分子流行病学中基因分型的一种很灵敏的方法,可以用于溯源调查。总结:1.在40多年内其耐药性在逐渐上升,同时MIC也在上升,1998年沙门氏菌分离株多重耐药性达到高峰(耐药率在50%以上)。2.人源和食源性沙门氏菌覆盖18个血清型,分离率最高的为肠炎沙门氏菌、德尔卑沙门氏菌和阿贡纳沙门氏菌。耐药表型主要为ACSSuTKNTm,ACSSuTK,CSSuTKNTm等。3.鸡白痢沙门氏菌主要携带blatem-1、tetA、sul2、strA-B和dfrA12基因,同一耐药表型通常由一个耐药基因控制,1997年以前的分离株都不含有I类整合子。4.食物源和人源MDR沙门氏菌主要有blatem-1、aadA1、blapse1、sul1、sul2、tetA、tetB、tetG、strA-B、floR、cmlA和dfrA12基因, I类整合子阳性率为31/39,同一种耐药表型由一种以上耐药基因控制。5.Ⅰ类整合子大小为0.3、0.6、1.0、1.2和1.6 kb,1.6kb(aadA5-dfr17)大小的整合子在细菌中分布广泛。可移动的DNA成分在耐药性的转移和分布中起到重要作用。6.沙门氏菌分离株gyrA发生点突变的位点与萘啶酮酸耐药水平高低存在一定的相关性,且导致对3种氟喹诺酮类药物的敏感性下降。7. marA、acrB和ompF的突变株表现出对许多抗生素敏感性的敏感性上升,对沙门氏菌多重耐药性影响较大的是外排泵机制。8.成功建立了沙门氏菌脉冲场凝胶电泳(PFGE)分型方法,血清型与PFGE图形之间存在相关性,耐药表型的差异对PFGE影响较小,地域性和时间性差异对沙门氏菌的PFGE图形产生的影响较大。