基于TRPV4探讨次乌头碱对黑色素瘤转移影响的机制研究

来源 :南京中医药大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:cerfa
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[研究背景与目的]寒热辨证是中医认识和治疗疾病的基本治法治则。阐明中医理论的现代科学内涵是推动中医药现代化和国际化的关键。课题组前期调研发现,寒热辨证对现代中医临床肿瘤治疗的遣方用药仍有重要指导意义,本论文尝试揭示其科学内涵并发掘药性的寒热与肿瘤寒热证候之间的关联,尝试从现代生物学角度进行科学解释。中医上有观点认为,位近体表的肿瘤属火者多,如乳腺癌、皮肤癌等,而与之相对的,内在脏腑的肿瘤多属寒,如胰腺癌、肾癌、肝癌、胃癌等。课题组通过前期研究发现,肿瘤的寒热证候可能与Transient Receptor Potential(TRP)通道家族存在密不可分的联系,在乳腺癌、皮肤癌等“热证”特征肿瘤的患者中,热敏受体表达明显增加;而在结肠癌、肝癌和胃癌等“寒证”特征肿瘤的患者体内,冷敏受体高表达现象较为常见。前期研究表明,在黑色素瘤这一侵袭性强的“热证”肿瘤中TRPV4异常高表达且与患者不良预后密切相关。通过对寒热中药活性成分与冷热敏受体激动/抑制剂进行结构拟合后,发现热性中药附子中的主要活性成分次乌头碱与TRPV4激动剂GSK1016790A拟合结果较高。进一步文献调研发现,附子这类温阳散寒的中药临床上主要用于治疗肝癌,胃癌等“寒证”肿瘤,并不用于皮肤癌这类“热证”肿瘤的治疗,符合“寒者热之,热者寒之”的治法治则,并且温阳派主张在肿瘤治疗中大剂量使用附子。课题组前期研究发现与TRPV4抑制剂结构拟合程度高的黄芩苷可以抑制TRPV4进而抑制黑色素瘤转移。那么次乌头碱对于TRPV4高表达的黑色素瘤影响是怎样的,是否在中医临床治疗“热证”肿瘤如黑色素瘤时应该慎用附子。本课题旨在明确“热属性化合物”次乌头碱对于“热证”肿瘤黑色素瘤转移的影响,并基于TRPV4探讨其可能的作用机制,为中医临床使用附子进行肿瘤治疗时提供新的思路与策略。[研究内容与结果]本文首先利用 TCGA、Cancer Cell Line Encyclopedia 以及 The Human Protein Atlas 数据库确定并选择高表达TRPV4的黑色素瘤作为研究对象。通过数据库调研发现,黑色素瘤细胞系中TRPV4表达较其他肿瘤细胞高,并且患者病灶组织免疫组化结果也显示出TRPV4表达较正常组织高,且患者的预后与TRPV4表达呈负相关。采用Western Blot、免疫荧光进行验证发现,人源黑色素瘤细胞株(A375、Sk-Mel-24、Malme-3M)TRPV4表达较人上皮细胞(HaCaT)高,其中A375的TRPV4表达水平最高。通过构建A375 TRPV4-/-细胞确定次乌头碱可以通过TRPV4介导A375细胞钙内流。通过体内外实验发现TRPV4的激动剂GSK1016790A以及“热属性化合物”次乌头碱可以通过TRPV4介导的钙内流促进黑色素瘤A375的转移。通过免疫荧光检测给予次乌头碱之后单细胞悬浮状态下A375细胞的极性,发现次乌头碱可以显著促进A375单细胞极化。通过构建Ezrin-EGFP的A375细胞,尾静脉注射并观察其在裸鼠肝脏以及肺部血管中的阻滞情况,发现次乌头碱促进A375在裸鼠肝肺部位的阻滞。体内实验注射使用次乌头碱干预后的A375细胞,发现次乌头碱可以通过促进A375极化(单细胞极性)进而促进黑色素瘤A375的转移。通过免疫荧光以及Western Blot检测不同浓度以及不同干预时间次乌头碱对Ezrin磷酸化的影响以及免疫组化检测转移灶部位p-Ezrin的水平发现,乌头碱对于A375细胞极化的影响可能是通过促进Ezrin磷酸化进行调控的。通过长时程活细胞观察系统观察次乌头碱对A375细胞阿米巴运动的影响,并且进行免疫组化、免疫荧光以及Western Blot检测次乌头碱对Rho/ROCK轴以及MLC磷酸化的影响发现,次乌头碱可以通过Rho/ROCK-MLC信号转导途径促进黑色素瘤细胞通过阿米巴样运动向周围组织侵袭。通过B16F10以及A375的皮下荷瘤实验进一步验证Rho/ROCK/MLC信号轴激活对于黑色素瘤细胞侵袭性的影响。荧光标记葡聚糖渗漏实验、免疫荧光以及Western Blot检测发现,次乌头碱还可以通过Rho/ROCK/MLC信号轴导致A375细胞的分泌特征改变,最终破坏HUVEC的紧密连接,并且这一作用在其外渗(Extravasate)的过程中可能发挥作用。[结论与意义]基于以上实验结果最终发现,次乌头碱通过TRPV4介导的钙内流激活ROCK/MLC2信号轴,导致黑色素瘤细胞获得阿米巴运动特征(导致其自身侵袭性增加)以及特殊的分泌特性(导致血管内皮细胞的细胞骨架重构,使得其渗透性增加),使得其从原位到达转移位点之后获得进一步在远端组织形成转移灶的优势。次乌头碱正是通过TRPV4/ROCK/MLC2途径在肿瘤细胞向周围入侵以及循环肿瘤细胞向血管内皮的粘附并破坏血管内皮紧密连接进而外渗的这两个关键过程积累后续的转移优势,最终导致黑色素瘤远端转移的发生。结合课题组前期发现“寒属性化合物”黄芩苷可以抑制“热证”肿瘤黑色素瘤转移的研究结果,本研究则发现“热属性化合物”次乌头碱会促进“热证”肿瘤黑色素瘤转移。因此,“寒者热之,热者寒之”的治法治则在现代中医临床治疗肿瘤时依然有其科学意义,在肿瘤治疗时要注重寒热辨证,合理组方,若“寒热不辨”则会造成严重后果。
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