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目的:探讨细胞外基质透明质酸(hyaluronan,HA)对肿瘤免疫调节的作用:1、研究乳腺癌患者外周血中M2样单核细胞的表达水平;2、探讨乳腺癌患者外周血M2样单核细胞与血浆HA之间的相互关系;3、探讨中分子量HA(INT-HA)如何通过miRNA调控M2样肿瘤相关巨噬细胞(tumor-associated macrophages,TAMs)形成的机制。方法:1、应用流式细胞术检测乳腺癌患者、良性疾病患者和健康体检者外周血中CD14~+CD163~+/CD14~+CD204~+/CD14~+CD163~+CD204~+M2样单核细胞的表达水平,分析其与临床病理资料的相关性;2、通过免疫组化方法观察乳腺癌和乳腺良性疾病组织中CD204~+M2样TAMs与HA的表达情况;3、通过化学发光方法检测乳腺癌患者、良性疾病患者和健康体检者血浆中HA、CEA、CA15-3的表达水平,并分析外周血M2样单核细胞与HA之间的相关性;4、磁珠分选外周血单核细胞,采用不同分子量及不同浓度的HA处理单核细胞72 h;5、应用RT-qPCR及ELISA检测HA处理后的单核细胞中与M2样TAMs相关的标记分子的表达水平(Arg1、IL-10、CCL18、CCL22及CCR2等);6、使用miRNA芯片技术分析HA处理后的单核细胞中miRNAs的表达变化;7、通过miRNA在线软件(TargetScan,miRDB和miRWalk)分析miRNA潜在的靶基因;8、根据HA处理前后miRNA的变化,在THP-1来源的巨噬细胞中转染相应的miRNA mimics或inhibitors,分析miRNA对于M2样TAMs的调节机制;9、通过RT-qPCR及Western blot验证miRNA的靶基因;10、收集实体瘤患者外周血单核细胞及相应血浆,使用RT-qPCR检测单核细胞中的IL-10、CCL18、miRNA及其相应靶基因的表达水平,应用化学发光法检测血浆中HA水平,分析这些指标之间的相互关系。结果:1、相对于良性疾病患者和健康体检者,乳腺癌患者外周血中CD14~+CD204~+M2样单核细胞明显升高;2、外周血CD14~+CD204~+M2样单核细胞水平对于乳腺癌诊断的敏感度和特异性优于CEA和CA15-3;3、CD204~+M2样TAMs与HA在乳腺癌组织中的表达明显高于乳腺良性疾病组织;4、CD14~+CD204~+M2样单核细胞与HA联合可提高乳腺癌的诊断敏感性和特异性;5、CD14~+CD204~+M2样单核细胞与TNM肿瘤分级、淋巴结转移、组织学分化之间存在明显相关性;6、相对于LMW-HA与HMW-HA,INT-HA刺激单核细胞发生M2样极化的效果最为显著;7、INT-HA主要通过TLR4引起巨噬细胞发生M2样极化;8、通过miRNA microarray分析INT-HA刺激与未刺激两组之间miRNA表达谱的变化,证实miR-935的表达降低最为明显;9、miR-935表达降低是通过INT-HA作用于巨噬细胞上TLR4引起的;10、miR-935在INT-HA引起的M2样巨噬细胞极化中发挥重要的调控作用;11、MiR-935可能通过作用靶基因C/EBPβ发挥调控M2样巨噬细胞极化的作用。结论:1、乳腺癌患者外周血中CD14~+CD204~+M2样单核细胞与血浆HA存在明显正相关,可联合辅助诊断乳腺癌。2、INT-HA能够引起巨噬细胞发生M2样极化;3、INT-HA引起巨噬细胞发生M2样极化可能通过TLR4-miR-935-C/EBPβ途径发挥作用,该途径可能成为一个新药物的治疗靶点。