论文部分内容阅读
烟粉虱MEAM1隐种(B型烟粉虱)是世界性的入侵害虫,90年代入侵我国后,迅速传播蔓延,成为多种植物上的害虫优势种,给农业生产造成重大损失。我们前期研究发现B型烟粉虱若虫取食能够诱导烟草系统叶对烟蚜的防御反应,而不能诱导局部叶对烟蚜的防御;并且与烟粉虱同科的温室白粉虱亦不能诱导此种抗性反应。本文通过RNA-seq技术测定比较了B型烟粉虱若虫危害前后烟草系统叶和局部叶,温室白粉虱若虫危害前后烟草系统叶转录组变化情况,筛选出B型烟粉虱若虫诱导烟草系统叶的特异性表达的基因;并利用荧光定量PCR技术、病毒诱导基因沉默技术,结合对烟蚜的生物活性测定结果进行比较分析,进一步筛选出与抗蚜相关的抗性基因;此外,通过测定B型烟粉虱若虫为害对烟草系统、局部叶位氧化还原环境及SA途径重要调控因子NPR1的亚细胞定位的影响差异,揭示系统叶和局部叶抗蚜反应差异产生机理,进一步揭示外来入侵害虫B型烟粉虱的入侵机制和爆发成因,并为开发植物诱导抗性物质、作物抗虫育种,有效实施烟蚜可持续治理提供理论依据。主要研究结果如下:1.以三生烟草为材料,基于Illumina二代测序平台的RNA-Seq技术,测定分析B型烟粉虱若虫为害后烟草叶片转录组变化,共获得表达基因48377个,其中37462个基因具有NR注释,24827个基因映射到1690个GO节点上。5643个基因获得了KEGG注释,分别归属254条途径,其中代谢途径(Metbolic process)的基因最多(766个),另外参与植物激素传导途径(Plant hormone signal transduction),苯丙烷物质合成途径(Phenylpropanoid biosynthesis)以及植物病原菌互作途径(Plant-pathogen interaction)的基因分别为197,190和167个。B型烟粉虱为害烟草的系统叶共有25087个基因较无虫对照叶上调,其中11574个基因具有GO功能注释,主要映射到系统免疫(Immune system process),信号转导(Single-organism processs)及代谢(Metbolic process)等节点,而8260个基因具有KEGG注释。2.对不同处理组的差异基因进行分析,发现与各自对照相比B型烟粉虱若虫为害后的系统叶和局部叶,温室白粉虱为害的系统叶差异表达基因分别为2204,7005和4951个(差异表达基因为FDR<0.001且倍数差异不低于2倍),其中上调基因分别为1547,3794和2809个。经进一步比较,获得B型烟粉虱若虫诱导系统叶特异性上调基因164个,其中143个基因具有NR注释,104个基因具有GO注释,主要映射到31个节点。注释到KEGG的pathway数据库的基因有34个,分别归属到21条代谢途径。其中归属到植物激素传导、苯丙烷物质合成和植物病原菌互作防御途径的基因有9个。3.根据差异基因的功能注释,结合前期研究结果,筛选了Nt WRKY41,NtWRKY70,NtEIG-E76,Chi4,Chi2 5个备选抗蚜基因,并进行功能验证,明确了NtWRKY70和NtEIG-E76基因在B型烟粉虱诱导烟草抗蚜防御中起重要作用。通过荧光定量PCR技术,发现NtWRKY41,NtWRKY70,NtEIG-E76,Nt Chi4 4个基因表达量在系统叶较局部叶明显上调,与转录组测序结果趋势一致。运用病毒诱导基因沉默技术沉默NtWRKY70和NtEIG-E76基因,发现在基因沉默植株上烟蚜的存活率要显著高于野生型植株。基因功能注释表明Nt WRKY41,Nt WRKY70为植物防御途径中的重要调控因子,NtEIG-E76和NtChi分别为重要防御酶β-1,3-葡聚糖酶和几丁质酶相关编码基因。4.发现B型烟粉虱诱导的烟草抗蚜防御依赖NPR1,明确B型烟粉虱取食对烟草植株局部叶、系统叶位NPR1蛋白核转运过程的不同调控作用,导致了烟草植株的抗蚜活性表现出在系统性上的差异。B型烟粉虱为害NPR1基因沉默植株后,系统叶位后取食烟蚜的存活率与对照相比差异不显著。通过定量PCR发现,NPR1表达量在局部及系统叶均显著升高,并无明显差异;而NPR1蛋白亚细胞定位试验结果显示,B型烟粉虱取食后局部叶NPR1蛋白的核转运过程受到抑制,分散在细胞质中,而系统叶的NPR1蛋白多聚集在细胞核内。不同叶位NPR1蛋白的定位不同,最终导致了系统抗蚜防御差异。5.发现B型烟粉虱诱导的烟草抗氧化能力升高与抗蚜活性成正相关;其中CAT能够影响SA途径,在抗蚜防御中起重要作用。B型烟粉虱若虫为害烟草后,过氧化氢酶(CAT)、抗坏血酸过氧化氢酶(APX)等抗氧化酶活性,及抗坏血酸(AsA)、还原型谷胱甘肽(GSH)等非酶促抗氧化物质含量在系统叶位显著增加,而在局部叶则一定程度降低。改变抗氧化酶CAT活性能够影响B型烟粉虱诱导的烟草抗蚜活性。运用基因沉默技术沉默Cat1能够抑制B型烟粉虱诱导的CAT活性,缓解系统叶对烟蚜的抗性;而在B型烟粉虱若虫为害的局部叶外源注射CAT则会促进抗蚜活性的产生,并且沉默Cat1可以抑制B型烟粉虱诱导的依赖NPR1的防御基因PR1,PR2的表达,我们推测B型烟粉虱诱导的抗氧化能力变化与NPR1调控的对烟蚜防御密切相关,是影响NPR1细胞定位的重要因子。