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目的线粒体质量受损是心肌缺血/再灌注损伤(MIRI)发生发展的关键因素。新近研究发现,白藜芦醇对衰老与代谢综合征等病理学损伤的改善作用,与其调控线粒体质量控制、提高细胞内线粒体质量有关。体内外研究表明,白藜芦醇能激活细胞能量代谢关键调控因子Sirtuin,并通过Sirtuin依赖性通路参与细胞能量代谢。本课题组前期研究已证实,白藜芦醇具有显著的抗心肌细胞缺氧/复氧损伤作用。在此基础上,本研究拟通过复制大鼠乳鼠原代心肌细胞缺氧/复氧损伤模型,探寻白藜芦醇防治MIRI的主要作用机制,探究“白藜芦醇通过Sirtuin蛋白对线粒体动态变化、线粒体自噬及线粒体生物合成的协同调控,改善线粒体质量,增强MIRI耐受性”的假说,为白藜芦醇防治MIRI提供实验依据。方法与结果本研究采用胰酶消化法体外分离大鼠乳鼠原代心肌细胞,利用三气培养箱法行心肌细胞缺氧12 h,复氧12 h,建立心肌细胞缺氧/复氧损伤模型。实验共分为5组,即正常对照组(Control组)、缺氧/复氧损伤模型组(H/R组)、5μM白藜芦醇组(Res-5组)、20μM白藜芦醇组(Res-20组)、Sirtuin抑制剂组(Ex527组)。白黎芦醇预处理大鼠乳鼠原代心肌细胞12h后,再行缺氧/复氧处理。本研究共分为三部分探讨白藜芦醇对缺氧/复氧损伤心肌细胞线粒体质量控制的调控机制。1.白藜芦醇调控缺氧/复氧损伤心肌细胞线粒体质量的研究通过倒置荧光显微镜、酶标仪检测线粒体膜电位(MMP,△Ψm)和细胞ATP含量,SOD检测试剂盒-WST检测SOD活性,MDA测试盒检测细胞MDA含量,评价心肌细胞线粒体损伤程度,并进行白藜芦醇对缺氧/复氧损伤心肌细胞线粒体质量的调控研究。结果发现:与Control组心肌细胞比较,H/R组MMP显著降低(P<0.005),细胞ATP含量下降约55%(P<0.005),SOD活性下降约40%(P<0.05),比较结果具有统计学意义;MDA含量明显高于Control组(P<0.05)。这表明,经缺氧/复氧处理后,心肌细胞线粒体遭受了较大程度的损伤。在白藜芦醇预处理组中,心肌细胞MMP、ATP含量和SOD活性均明显升高(P<0.005或P<0.05);MDA含量则明显下降(P<0.05),与H/R组比较差异显著。这些实验结果均表明,白藜芦醇预处理能够明显提高线粒体抗氧化能力,减轻缺氧/复氧对心肌细胞线粒体的损伤。在Ex527组,缺氧/复氧后心肌细胞厘MMP、ATP含量较Res-20组显著下降(P<0.005);与Res-20组比较,细胞SOD活性下降约51%(P<0.05),MDA含量则升高约41%(P<0.05),差异显著。这些结果表明白藜芦醇可通过Sirtuin蛋白对缺氧/复氧损伤心肌细胞线粒体发挥保护作用。2.白藜芦醇对缺氧/复氧损伤心肌细胞Sirtl/Sirt3的调控研究通过Sirt1、Sirt3活性荧光定量检测试剂盒检测心肌细胞内Sirt1和Sirt3活性,通过Western Blot检测Sirt1、Sirt3及其下游蛋白FoxO1、Fox03a的蛋白表达水平,通过Real-TimePCR技术检测FoxO1和Fox03a转录水平,考察白藜芦醇对缺氧/复氧心肌细胞内Sirt1、Sirt3的调控作用。结果发现:与H/R组心肌细胞相比,白藜芦醇预处理组心肌细胞内Sirt1和Sirt3去乙酰化酶活性均有所上升,且呈剂量依赖性,Res-20组心肌细胞内Sirt1和Sirt3去乙酰化酶活性增强更为显著(P<0.005或P<0.05);白藜芦醇预处理后,Fox03a的蛋白表达水平较H/R组有上调趋势;在Res-20组心肌细胞内,Sirt1、Sirt3、FoxO1的蛋白表达水平均明显升高(P<0.01或P<0.05),与H/R组比较具有统计学差异;缺氧/复氧损伤心肌细胞内FoxO1和Fox03a的mRNA水平随白藜芦醇剂量升高而呈现明显的上升趋势(P<0.005,P<0.01或P<0.05)。这些结果表明白藜芦醇既可上调缺氧/复氧损伤心肌细胞内Sirt1和Sirt3的去乙酰化酶活性,也能增强Sirt1和Sirt3的蛋白表达,从而促进Sirt1/Sirt3下游靶蛋白FoxO1和Fox03a的转录和翻译。Sirtuin抑制剂Ex527的加入可明显削弱白藜芦醇对缺氧/复氧损伤心肌细胞内Sirt1和Sirt3活性的上调(P<0.005或P<0.05);与Res-20组比较,Ex527组心肌细胞内Sirt1的蛋白表达水平有下降趋势,Sirt3、FoxO1和FoxO3a的蛋白表达水平显著降低(P<0.01或P<0.05);Fox01和FoxO3a的mRNA表达水平较Res-20组均呈下降趋势(P<0.05)。这些结果证实了Ex527对Sirt1/Sirt3活性的抑制作用,并进一步表明Sirt1/Sirt3-FoxO通路参与白藜芦醇对缺氧/复氧损伤心肌细胞线粒体的保护作用。3.Sirt1/Sirt3通过调控线粒体质量控制参与白藜芦醇抗心肌细胞线粒体缺氧/复氧损伤保护作用的研究通过激光共聚焦观察线粒体质量,通过Real-Time PCR法检测心肌细胞内 Mfn1、Mfn2、Opa1、Drp1、Fis1、PGC-1α 的 mRNA 表达水平,评估心肌细胞内线粒体分裂与融合状态和线粒体生物合成活性;通过Western Blot检测心肌细胞内LC3、PINK1、Parkin的蛋白表达水平,激光共聚焦考察心肌细胞内线粒体自噬溶酶体水平,免疫共沉淀法检测p62与Parkin的结合程度,以评价心肌细胞内线粒体自噬活性,对白藜芦醇介导的缺氧/复氧损伤心肌细胞内线粒体质量调控进行研究。结果发现:经白藜芦醇预处理后,缺氧/复氧损伤心肌细胞内线粒体分裂与融合调控蛋白Drp1、Mfn1、Mfn2、Opa1的mRNA表达水平显著提高(P<0.005或P<0.05),Fis1的mRNA表达水平有所上升;与H/R组比较,白藜芦醇预处理组心肌细胞内线粒体生物合成关键调控因子PGC-1 α的mRNA水平明显提高(P<0.005或P<0.01);线粒体经红、绿荧光探针染色后,在激光共聚焦显微镜下观察,Res-20组心肌细胞线粒体网络化程度较H/R组增强,正常功能线粒体数量和线粒体总数均随白藜芦醇剂量的提高而增多(P<0.05),且较H/R组具有统计学差异。这些结果表明,白藜芦醇能够通过促进缺氧/复氧损伤心肌细胞内线粒体分裂与融合和上调线粒体生物合成,调控线粒体动态变化。与H/R组相比较,Res-20组心肌细胞内LC3-Ⅱ和Parkin的蛋白表达水平显著升高(P<0.05),线粒体自噬溶酶体数量明显增加(P<0.01或P<0.05);白藜芦醇预处理组心肌细胞内p62与Parkin的结合程度均有明显上升(P<0.05),这表明白藜芦醇可以通过上调Parkin依赖性通路诱导缺氧/复氧损伤心肌细胞内线粒体自噬活性。在Ex527组中,心肌细胞内Drp1、Mfn1、Mfn2、Opa1的mRNA表达水平较Res-20组均有所下降,其中Mfn2的mRNA表达水平降低更为显著(P<0.05);激光共聚焦显微镜下观察经荧光探针标记的线粒体,与Res-20组比较,Ex527组正常功能的线粒体数量和线粒体总数显著降低(P<0.05);这表明Sirtuin抑制剂的加入减弱了白藜芦醇对缺氧/复氧损伤心肌细胞内线粒体动态变化的调控。与Res-20组比较,Ex527组心肌细胞内线粒体自噬溶酶体的数量急剧减少(P<0.005),LC3-II和Parkin的蛋白表达水平明显降低(P<0.05),p62与Parkin的结合程度较Res-20组心肌细胞有明显的下降趋势(P<0.01),表明Sirt1/Sirt3-Parkin信号通路诱导的线粒体自噬是白藜芦醇调控缺氧/复氧心肌细胞内线粒体质量的关键机制。结论1.白藜芦醇能明显提高缺氧/复氧损伤心肌细胞内MMP、ATP含量和SOD活性,减少细胞MDA含量,对缺氧/复氧损伤心肌细胞线粒体具有显著的保护作用。2.白藜芦醇对缺氧/复氧损伤心肌细胞内线粒体的保护作用可能与Sirt1/Sirt3-FoxO信号通路的激活有关。3.白藜芦醇可通过Sirt1/Sirt3促进线粒体分裂与融合,加速受损线粒体与线粒体网络的分裂,促进线粒体间物质交换,调控线粒体质量。其保护机制可能与Sirt1/Sirt3介导线粒体分裂与融合关键调控因子mRNA水平上调有关。4.白藜芦醇对缺氧/复氧心肌细胞线粒体的保护作用与Sirt1/Sirt3-Parkin信号通路有关,其可能的保护机制之一是通过促进Parkin的蛋白表达,增强p62与Parkin的结合程度,进而激活线粒体自噬缓解缺氧/复氧诱导的线粒体损伤。5.白藜芦醇可通过Sirt1/Sirt3促进缺氧/复氧损伤心肌细胞内线粒体生物合成调控线粒体质量,其机制可能与上调PGC-1α表达有关。