纳豆激酶是一种具有潜力的溶栓药物。它能够有效减缓血栓的形成,且溶栓作用明显高于同等剂量的尿激酶,同时它也能够通过蛋白水解作用直接溶解纤维蛋白凝块。本论文从贵州本土特色食品中分离筛选出的高产纳豆激酶的菌株,通过对其进行综合性能评价,包括安全性能、益生性能和发酵性能的评价。在此基础上采用主成分析,找到综合性能最好的一株高产纳豆激酶菌株。通过丙酮沉淀法和反胶束萃取法相结合对粗酶液进行纯化得到电泳纯的纳豆激酶,最后采用多种化学修饰相结合的方法对纳豆激酶进行酶学改造,并研究其酶学稳定性。首先本实验采用酪蛋白平板法和琼脂糖—纤维蛋白原平板法从贵州本土特色食品的样品中分离出能水解酪蛋白的菌株,并得到78株菌产纳豆激酶的菌株。通过对15株高产纳豆激酶菌株的菌落形态和菌体形态观察,初步判断15株高产纳豆激酶菌株均为芽孢杆菌属（Bacillus）。最后通过紫外分光光度法对筛选得到的15株高产菌株进行纳豆激酶酶活力精确测定。测得菌株GUJN05产酶能力最高,其固态发酵36 h后的纳豆激酶活力达到141.97±0.64 FU/g。然后将15株高产纳豆激酶菌株经16S rRNA分子生物学初步鉴定,菌株GULR06、GUMN16、GUTU06、GUYZ13为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）;菌株GUB01、GULC07、GUXN01、GUJN05、GUXN04、GUJZ01、GUWB03、GUBN02、GUYR02和GUWB06为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）;SN-14菌株为贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）。各纳豆产品的生物胺含量在49.09⁷3.71 mg/kg,其中GUMN16菌株产生物胺含量最高。通过主成分分析选择贝莱斯芽孢杆菌SN-14作为纳豆激酶的生产菌株,结合形态学、分子生物学和生理生化鉴定结果,最终鉴定SN-14为贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）。接着采用丙酮沉淀法从发酵液中初步分离提纯纳豆激酶。当发酵液和丙酮的体积比为1:5时,在0℃下沉淀6 h的效果最佳,在该条件下纳豆激酶酶活力回收率为69.7±1.3%,纯化倍数为1.89±0.05。采用反胶束法萃取丙酮沉淀后的纳豆激酶溶液,前萃取的最优条件为:当CTAB浓度为225 mM,三种助溶剂体积为70%异辛烷/20%正丁醇/10%正己醇;水相中NaCl离子浓度为0.05 M,水相pH为8.5;在25℃条件下萃取25 min,离心后得到含纳豆激酶的有机相,在该条件下前萃取效率达到了75.3±1.8%。反萃取的最优条件为:有机相来自前萃取离心后所得;水相中KCl的盐离子浓度为1.5 M,水相为pH 6;在30℃条件下萃取75 min,离心后得到含纳豆激酶的水相,在该条件下反萃效率为84.7±1.9%。丙酮沉淀后的纳豆激酶溶液经过反胶束萃取分离提纯后,总的反胶束萃取效率为63.8±1.9%,纯化倍数为2.61±0.09。发酵液中的纳豆激酶经过丙酮沉淀和反胶束萃取,整个过程的纯化倍数达到4.93。采用本研究方法分离纯化后的酶溶液经过SDS-PAGE表征发现该方法可以将目标酶提纯至电泳纯,经过NanoLC-ESI-MS/MS测定该酶的氨基酸序列,通过系统发育树分析得出纯化后的SN-14菌株所产的酶属于纳豆激酶家族,并将该酶命名为SG14。最后通过测定除去金属离子SG14 NK前后的纳豆激酶含量,得到去离子后的NK酶活力比去离子前的NK酶活力提高了9.17%。K⁺、Ca²⁺、Mg²⁺、Ba²⁺和Fe²⁺对未修饰的SG14 NK酶活力有一定程度的促进作用,其中Fe²⁺对纳豆激酶酶活力的促进作用最强,酶活提高倍数达到11.3%,其它的金属离子都表现出一定程度的抑制。当Fe²⁺浓度在10 mM时,SG14 NK酶活力达到最大,相对于原来只用5 mM去促进纳豆激酶活力又提高了16.7%,而相对于没进行化学修饰前的SG14 NK提高了3.1倍。Fe²⁺和mPEG化学修饰后的SG14 NK与胃蛋白酶溶液等体积混合反应时酶活力达到最高,相对只进行过Fe²⁺和mPEG修饰后的SG14NK,酶活力提高了1.66倍。在37℃的最佳反应温度下,依次完成Fe²⁺、mPEG和胃蛋白酶修饰后的SG14 NK的酶活力最高,其NK的酶活力是未经过化学修饰的SG14 NK的7.3倍。SG14 NK的最适pH为8.5,依次完成Fe²⁺、mPEG和胃蛋白酶修饰后的SG14 NK在pH为3和12时,NK酶活力分别损失9%和15.9%。只有Ca²⁺和Fe²⁺能对依次完成Fe²⁺、mPEG修饰的SG14 NK和依次完成Fe²⁺、mPEG和胃蛋白酶修饰的SG14 NK酶活力起到促进作用。在冻藏时间达到30天时,未化学修饰的SG14 NK的酶活力损失60.6%、Fe²⁺修饰后的SG14NK的酶活力损失56.6%、Fe²⁺和mPEG修饰后的SG14 NK的酶活力损失39.1%、Fe²⁺、mPEG和胃蛋白酶修饰后的SG14 NK的酶活力损失33.2%。而通过多种化学修饰后的SG14 NK的半衰期时间远高于未修饰的SG14 NK。