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研究目的：肿瘤一直以来都是严重危害人类健康的一类疾病,其起病隐匿、进展迅速、恶性程度高、治疗困难、死亡率高、多数预后较差的特点,使得一些肿瘤患者在被确诊时已是中晚期,失去了治疗的机会。我国是多种常见肿瘤如肺癌、肝癌等的高发区。如何阻断肿瘤的生长、侵袭和转移是目前肿瘤治疗研究的焦点。肿瘤的基因治疗,无论是在基础研究还是临床研究中,一直以来都是备受关注的热点问题。CD151是四次跨膜蛋白超家族中的重要成员之一,能够与多种不同的细胞内蛋白质分子结合在一起,参与促进肿瘤细胞的运动,调节肿瘤细胞的生长、迁移和侵袭。研究表明,调节细胞运动和迁移是CD151分子最显著地特征。临床试验结果已经证实,CD151参与肿瘤的转移和侵袭,与多种肿瘤的不良预后存在着密切的关系。为了进一步明确CD151及其相关分子复合物在人类肿瘤发生、发展过程中的作用,我们构建了RAAV-CD151-QRD194-196_RAAV-CD151-AAA194-196突变体,特异性的破坏CD151与整合素分子之间的联系。并设计合成针对CD151基因的SIRNA序列,沉默CD151表达。本实验研究的最终目的在于探索CD151在体内外肿瘤生长、侵袭和迁移中的重要作用,以及破坏CD151与整合素分子α3,α6,β1亚基复合体的形成,对体内外肿瘤细胞生长、存活、迁移和侵袭的重要影响,包括对细胞TEM之间信号传递的分子机制。研究方法：1.构建RAAV-CD151重组体质粒、RAAV-CD151-QRD194-196-RAAV-CD151-AAA194-196突变体质粒及RAAV-GFP阴性对照质粒。并用质粒大提试剂盒对构建成功的三种质粒进行大量提取。2.设计并合成特异性针对CD151的小分子干扰RNA即CD151-SIRNA,及乱序的阴性对照SIRNA。3.分别将前面准备好的各实验组质粒DNA及各实验组SIRNA通过脂质体介导的基因转染的方法瞬时转入人肝癌HepG2细胞、肺癌A549细胞、宫颈癌Hela细胞中,观察其对三种肿瘤细胞生物学行为的影响。4.免疫共沉淀实验检测比较重组体质粒RAAV-CD151、突变体质粒RAAV-CD151-QRD194-196-RAAV-CD151-AAA194-196及阴性对照质粒RAAV-GFP转染后肿瘤细胞中CD151与整合素α3、α6、β1亚基结合力的改变。5.MTT法、transwell趋化小室法分别检测三种肿瘤细胞经过干预处理后体外增殖、迁移及侵袭能力的差异。6. Western blot检测CD151表达缺失或CD151-整合素复合体破坏,对肿瘤细胞体外增殖、迁移、侵袭相关的信号通路蛋白分子的磷酸化影响。7.检测CD151-整合素复合体在人肿瘤组织及癌旁组织中的表达及组织学定位。8.构建裸鼠肝癌移植瘤模型,并通过尾静脉注射各实验组质粒,观察CD151-整合素复合体对肿瘤细胞体内生长、存活、转移和侵袭的影响。Western blot检测有关信号通路中蛋白质分子磷酸化的改变。同时免疫荧光双标记实验观察各实验组中CD151与整合素分子在裸鼠肿瘤组织中的共定位。实验结果：1.成功构建RAAV-CD151重组体质粒、RAAV-CD151-QRD194-196-RAAV-CD151-AAA194-196突变体质粒及RAAV-GFP阴性对照质粒。2.成功完成CD151-SIRNA的设计及合成,同时合成相应的阴性对照SIRNA。3.RAAV-CD151重组体质粒、RAAV-CD151-QRD194-196-RAAV-CD151-AAA194-196突变体质粒、RAAV-GFP阴性对照质粒；以及CD151-SIRNA和阴性对照SIRNA向人肝癌HepG2细胞、肺癌A549细胞、宫颈癌Hela细胞内的瞬时转染,并用western blot检测,实现对目标蛋白的表达调节,符合后面的实验要求。4.免疫共沉淀检测结果证实RAAV-CD151-QRD194-196-RAAV-CD151-AAA194-196突变体质粒转染后,肿瘤细胞内CD151表达上调,但CD151与整合素α3、α6、β1亚基结合能力被破坏。5.CD151-整合素复合体能有效促进肿瘤细胞的体外增殖、迁移和侵袭能力,破坏CD151与整合素分子之间的联系,其相应的生物学功能遭到破坏。同时,肿瘤细胞中CD151表达受抑制以后,细胞的体外增殖、迁移和侵袭力亦显著下调。6.CD151-整合素复合体促进细胞信号蛋白FAK, P130CAS磷酸化激活,失去了与整合素的完整性结合,相应的FAK, P130CAS磷酸化激活受到抑制。7.人肺癌、结肠癌组织中CD151基因及蛋白表达水平明显高于周围正常组织,且CD151与整合素分子共同定位于肿瘤组织中细胞周边。8.成功建立裸鼠肝癌移植瘤模型,并完成对裸鼠肿瘤CD151的表达调节。CD151表达上调能有效促进裸鼠体内肿瘤的生长、存活、侵袭和转移。保护肿瘤细胞免受顺铂诱导的凋亡。同时CD151-整合素复合体定位于细胞周边连接的部位,破坏CD151与整合素的联系,上述肿瘤进展事件全部受到抑制。实验结论：CD151促进体内外肿瘤生长、迁移和侵袭,调节肿瘤细胞内外信号蛋白FAK/P130CAS磷酸化激活,这一生物学功能的发挥是整合素依赖性的。无论是破坏CD151与整合素复合体的形成,还是特异性的沉默CD151的表达,其促肿瘤作用都将明显受到抑制。