第一部分硫喷妥钠对大鼠前额叶皮层细胞外液谷氨酸和γ-氨基丁酸含量的影响 目的:应用在体微透析技术，探讨腹腔注射或前额叶皮层局部灌注硫喷妥钠对大鼠前额叶皮层细胞外液谷氨酸和γ-氨基丁酸含量的影响。 方法:选用成年SD大鼠，实验前一周饲养于光照与黑暗交替、温度为24℃左右的环境中。实验当天，腹腔注射10％水合氯醛麻醉大鼠，将大鼠颅骨应用脑立体定位仪固定，根据大鼠脑图谱所示位置将微透析外套管埋置于前额叶皮层内，应用牙托粉固定，然后将大鼠放入笼中单独饲养。48h后取出外套管管芯，放置微透析探头连接微灌流泵，以2[l/min持续灌注人工脑脊液(ACSF)，60min后开始收集透析液，每10min1次共3次，取3次谷氨酸和GABA含量的平均值作为基础值，然后将大鼠分为两大组(n=6)：一组为腹腔注射硫喷妥钠(30mg/kg或50mg/kg)，腹腔注射生理盐水(NS)5ml/kg作为对照，然后持续灌流130min;另一组经微透析探头灌注硫喷妥钠(10～300μmol/L)持续10min，然后应用ACSF灌流70min。每10min收集1次透析液，保存于-70℃。实验结束后将大鼠脑应用多聚甲醛灌注固定并切成冠状切片，在光镜下确定微透析探头痕迹位置的正确性。应用反相高效液相色谱法测定灌流液中谷氨酸和GABA浓度。 结果:(略） 结论:硫喷妥钠腹腔注射或前额叶皮层局部灌注均可降低大鼠前额叶皮层细胞外液中谷氨酸含量，但GABA含量不受影响。 第二部分硫喷妥钠前额叶皮层作用的突触前机制 一、硫喷妥钠对大鼠突触体谷氨酸和GABACa2+依赖性和Ca2+非依赖性释放的影响 目的:应用大鼠前额叶皮层突触体模型，观察不同浓度的硫喷妥钠对谷氨酸及GABACa2+依赖性和Ca2+依赖性释放的影响。 方法: 应用成年SD大鼠，制备前额叶皮层突触体，用人工脑脊液孵育，分组为：对照组(Control组，不加入硫喷妥钠)、硫喷妥钠10μmol/L组(THS10组)、硫喷妥钠30μmol/L组(THS30组)、硫喷妥钠100μmol/L组(THS100组)、硫喷妥钠300μmol/L组(THS300组)，每组中含8份突触体。各组于37℃水浴中孵育15min，然后向ACSF中加入30mmol/L的KCl或20μmol/Lveratridine(自发释放时不加入高浓度KCl或veratridine)，继续反应5min，加入乙二醇双(2氨乙基)四乙酸(EGTA，Ca2+螯合剂，终浓度为10mmol/L)终止反应，迅速将各组中突触体反应液置于冰水浴中，以12000g离心20min，取上清液于-70℃保存，待测谷氨酸和GABA浓度。上述各浓度硫喷妥钠均在37℃水浴前加入到突触体混悬液中。观察Ca2+非依赖性递质释放时，将ACSF中Ca2+、二氢海人藻酸(谷氨酸转运体抑制剂)、哌啶酸(GABA转运体抑制剂)去除，分组与步骤均同Ca2+依赖性释放。实验过程中，由同一只大鼠前额叶皮层制得的突触体在同一组中不重复使用。应用反相高效液相色谱法测定反应液中谷氨酸和GABA浓度。 结果：（略） 结论:临床相关浓度的硫喷妥钠可抑制大鼠前额叶皮层突触前膜Ca2+依赖性谷氨酸释放，但对GABACa2+依赖性释放及谷氨酸和GABACa2+非依赖性释放则不产生影响。 二、突触前膜GABAA受体在硫喷妥钠抑制谷氨酸Ca2+依赖性释放中的作用 目的:应用大鼠前额叶皮层突触体模型，探讨突触前膜GABAA受体在硫喷妥钠抑制谷氨酸Ca2+依赖性释放中的作用。 方法:应用成年SD大鼠，制备前额叶皮层突触体，用人工脑脊液孵育，分组为：对照组(Control组，不含荷包牡丹碱及硫喷妥钠)、荷包牡丹碱0.1mmol/L组(Bic组)、荷包牡丹碱0.1mmol/L+硫喷妥钠10μmol/L组(THS10+Bic组)、荷包牡丹碱0.1mmol/L+硫喷妥钠30μmol/L组(THS30+Bic组)、荷包牡丹碱0.1mmol/L+硫喷妥钠100μmol/L组(THS100+Bic组)、荷包牡丹碱0.1mmol/L+硫喷妥钠300μmol/L组(THS300+Bic组)，每组含8份突触体。谷氨酸Ca2+依赖性释放的实验步骤同上。荷包牡丹碱(终浓度为0.1mmol/L)和不同浓度的硫喷妥钠(终浓度10～300μmol/L)于37℃水浴前加入ACSF中，其中Bic组中不加硫喷妥钠以观察Bic本身对递质自发释放及KCl或veratridine诱发释放的影响。应用反相高效液相色谱法(RP-HPLC)测定反应液中谷氨酸浓度。 结果:应用荷包牡丹碱后，Bic组突触体谷氨酸自发释放及KCl或Veratridine诱发释放与Control组比较无显著性差异(P＞0.05)，硫喷妥钠各浓度组中，谷氨酸释放水平与Control组比较亦无显著性差异(P＞0.05)。 结论:突触前膜GABAA受体介导硫喷妥钠对大鼠前额叶皮层谷氨酸Ca2+依赖性释放的抑制作用。 第三部分硫喷妥钠前额叶皮层作用的突触后机制—对锥体神经元NMDA和GABAA受体电流的影响 目的:应用急性分离的大鼠前额叶皮层锥体神经元，观察硫喷妥钠对NMDA受体和GABAA受体电流的影响。 方法:3～4周龄SD大鼠，雌雄不拘，击昏后断头，分离前额叶皮层，应用细菌蛋白消化法分离锥体细胞。采用全细胞膜片钳纪录模式，玻璃微电极阻抗为3-6MΩ，选用胞体较大、呈椭圆形或锥形、含有明显突起的细胞，密封电阻大于1GΩ的膜片进行全细胞电流记录，膜电位钳制于-60mV，实验在室温(22℃～23℃)条件下进行。距离锥体细胞100～200μm给予3～1000μmol/L不同浓度的NMDA，以观察NMDA诱发电流的量效关系。观察硫喷妥钠对NMDA受体电流的影响时，给予100μmol/LNMDA与不同浓度硫喷妥钠，给药时间为8s，两次给药之间的间隔时间为1.5min，施加于锥体细胞的硫喷妥钠浓度为10μmol/L～1000μmol/L。观察GABA电流时，细胞外液中不加glycine，向锥体细胞施加3～300μmol/L不同浓度的GABA，以观察GABA诱发电流的量效关系。观察硫喷妥钠对GABA电流的影响时，给予10μmol/LGABA与10～1000μmol/L不同浓度的硫喷妥钠，给药时间为4s，两次给药间歇时间为4min。观察IC50水平的硫喷妥钠对NMDA诱发电流的影响时，同时给予不同浓度的NMDA与IC50水平的硫喷妥钠，施加于锥体细胞的NMDA浓度为3～1000μmol/L。另外同时施加3～300μmol/L不同浓度的GABA与EC50水平的硫喷妥钠，以观察EC50水平的硫喷妥钠对GABA诱发GABAA电流的影响。 结果:不同浓度的硫喷妥钠单独加药时不诱发锥体细胞产生电流。应用3～1000μmol/LNMDA可诱发内向电流的产生，并可被50μmol/LAPV完全拮抗，NMDA的EC50为53.6±12.4μmol/L。在10～1000μmol/L硫喷妥钠影响下，100μmol/LNMDA诱发的内向电流幅度分别为对照组(不加硫喷妥钠)的81％、70％、35％、15％、12％。各浓度组中电流幅度与对照组比较均具有显著性差异(P＜0.01)。硫喷妥钠对NMDA诱发内向电流的IC50为33.6±6.1μmol/L。3～300μmol/LGABA可诱发内向电流的产生，并可被1～100μmol/LBicuculline完全拮抗。其EC50为20.2±2.2μmol/L。在10～1000μmol/L硫喷妥钠影响下，10μmol/LGABA诱发的内向电流幅度分别为对照组的126％、145％、175％、191％、192％，与对照组比较均有显著性差异(P＜0.01)，硫喷妥钠的EC50为26.9±3.0μmol/L。33.6μmol/L硫喷妥钠使NMDA效应曲线发生右移，NMDAEC50由对照组(不加硫喷妥钠)的53.6±12.4μmol/L增至128.3±15.0μmol/L(P＜0.01)。26.9μmol/L硫喷妥钠使GABA效应曲线发生左移，GABAEC50由对照组的20.2±2.2μmol/L降至10.5±1.9μmol/L(P＜0.01)。 结论:临床相关浓度的硫喷妥钠可显著抑制前额叶皮层锥体细胞NMDA受体电流并增强GABAA受体电流。