背景吸入全麻药是一类挥发性的麻醉气体，它们的共同特性是抑制中枢神经系统（central nervous system，CNS）活性。与抑制CNS相反，一些全麻药可以兴奋外周伤害性感受器，具有刺激性。目前，从临床观察来看，吸入异氟烷和地氟烷时，病人经常出现剧烈咳嗽，严重者出现喉痉挛，而七氟烷较少出现呼吸道并发症。全麻药对气道刺激的作用机制尚不清楚，但是其临床特征提示它们可能激活气道内的伤害性感受器。本课题组前期研究发现有些吸入全麻药能提高肺部重要的伤害性感受器——迷走神经C纤维的兴奋性，促进P物质的释放。结合国内外研究现状，我们推测挥发性吸入全麻药通过激活迷走C纤维和位于肺传入神经末梢的瞬时感受器电位阳离子通道（transient receptor potential cation channels, TRPs），产生中枢反射和轴突反射，引起咳嗽和喉痉挛等呼吸道症状。目的1.探讨挥发性全麻药对支配肺的迷走神经C纤维的影响，观察吸入麻醉下，C纤维对其他化学刺激的敏感性变化；2.观察瞬时感受器电位离子通道（主要是TRPA1和TRPV1）调节的离体肺组织伤害性感受器对挥发性全麻药的敏感性变化；3.观察迷走传入初级神经元上表达的瞬时感受器电位离子通道（主要是TRPA1和TRPV1）对以异氟烷为代表的刺激性全麻药的反应性；4.离体和细胞实验中挥发性麻醉药的给药途径比较特殊，需要制备挥发性全麻药溶液，探讨挥发性全麻药溶液如何制备以及离体实验中麻醉效能的改变。方法1.采用在体记录迷走神经单纤维的方法，观察肺C-fiber对不同浓度（0.5MAC、1MAC、2MAC）异氟烷和七氟烷的反应。确定异氟烷可以激活C-fiber后，在给予异氟烷通气的状态下，观察C-fiber对给予辣椒素刺激的敏感性有无变化；2.采用离体肺组织记录迷走神经单纤维的方法，选择只对化学刺激有反应的感受野，给予相当于等效临床浓度（0.5MAC、1MAC、2MAC）的异氟烷、地氟烷和七氟烷的Krebs溶液，观察支配这些感受野的C-fiber放电活动。为进一步确定TRPA1在气道感受器对全麻药的敏感性中的作用，观察TRPA1拮抗剂HC-030031对异氟烷和地氟烷引起的反应是否有阻断作用；为进一步确定TRPV1在气道感受器对全麻药敏感性中的作用，采用TRPV1基因敲除小鼠，观察离体肺C-fiber对不同浓度异氟烷和地氟烷溶液的反应；3.用荧光指示剂逆行标记小鼠结状神经节中支配肺的神经元，7-10天后急性分离培养迷走初级传入神经元，用钙成像的方法观察支配肺的迷走初级神经元上的TRPV1和TRPA1通道对异氟烷的反应；给予TRPA1拮抗剂HC-030031灌流，观察异氟烷对细胞内的钙信号强度有无改变；给予异氟烷灌流的情况下再给予辣椒素，观察细胞内的钙信号是否增强；4.配制吸入全麻药的Krebs溶液至过饱和，用气相色谱/质谱分析法检测三种麻醉药饱和溶液的浓度，检测可用于离体和细胞实验的稀释若干倍数的溶液浓度；为了观察挥发性，将同样浓度的稀释溶液敞口静置15min后检测溶液浓度；检测灌流槽内的麻醉药溶液浓度，评估麻醉药在实验过程中的损失。结果1.一共在23只大鼠颈部迷走神经上记录到30根C-fiber，其中异氟烷（isoflurane）组18根，七氟烷（sevoflurane）组12根。静息状态下C-fiber的基础放电频率为0.55±0.07impulse/s，这些C-fiber对capsaicin的激活时间为1.62±0.14s，C-fiber被激活后的放电频率为4.55±0.51impulse/s。吸入0.5MAC异氟烷后，C-fiber的放电频率（0.95±0.1impulse/s）没有明显增加（p>0.1），吸入1MAC异氟烷后，C-fiber的放电频率（2.2±0.25impulse/s）明显高于静息状态下的基础放电（p <0.01），当吸入浓度增加到2MAC时，C-fiber的放电频率进一步增加（4.18±0.31impulse/s），高于基础放电（p <0.01），也高于0.5MAC和1MAC组（p <0.01）。吸入三种浓度的七氟烷均不能引起C-fiber放电频率的增加（p>0.1）。1MAC和2MAC异氟烷对C-fiber的刺激作用也显著高于同等浓度的七氟烷（p <0.01）。虽然异氟烷可以激活C-fiber，但是放电频率低于capsaicin（p <0.01），在吸入isoflurane的状态下，经颈内静脉给予同等剂量的capsaicin，C-fiber放电频率明显高于纯氧通气时静脉注射capsaicin的反应（p <0.01）。2.在小鼠离体肺组织上一共得到124/226（54.9%）个纤维是可以纳入观察的C-fibers。向感受野注射三种浓度的isoflurane和desflurane后，纤维放电均高于基础放电（p <0.01），2MAC的isoflurane和desflurane引起的纤维放电高于0.5MAC（p <0.05），sevoflurane组与基础放电相比没有明显变化（p>0.05）。相同MAC浓度下，isoflurane和desflurane组高于sevoflurane组（p<0.01），isoflurane和desflurane组间无差别（p>0.05）。用30μM HC-030031灌流10min后，向感受野注射isoflurane和desflurane溶液，发现isoflurane和desflurane对气道感受器的刺激作用被明显抑制。TRPV1基因敲除（knock out，KO）小鼠的肺中分离出30根C-fiber。用相当于1MAC、2MAC的isoflurane和desflurane溶液注射入感受野，发现C-fibers仍可以被激活，但是放电频率较野生型小鼠减弱，两个浓度的isoflurane对KO小鼠的气道刺激均小于野生型小鼠（p<0.05），给予30μM HC-030031灌流后isoflurane和desflurane引起的纤维放电均被抑制（p<0.01）。3.急性分离的结状神经节（nodose ganglia，NG）经酶解消化后获得单个神经元，支配肺的迷走初级传入神经元占20％~30％。2MAC isoflurane和0.3mM CA都可以使胞内钙浓度增加； TRPA1阻断剂HC-030031能抑制isoflurane对nodose神经元的兴奋作用。2MAC isoflurane可以增强capsaicin对TRPV1的激活作用，胞内钙浓度明显增高；以第一次给capsaicin的相对荧光强度△F/F0作为标准，isoflurane+capsaicin能明显增加胞内钙浓度（p <0.01）。4.用气相色谱/质谱分析法测得三种麻药饱和溶液浓度（mM）分别为：Isoflurane15.7±0.5；Desflurane20.2±0.8；Sevoflurane6.0±0.3。静置15min后母液浓度并没有明显下降，地氟烷和异氟烷母液浓度甚至还略有上升，但与密闭组相比没有统计学差异（p>0.05）。从稀释溶液中取的样本测得的数值总是小于计算值，这部分代表了麻药准备期的损失，占到2-13%。在灌流过程中浴槽内的麻药浓度迅速上升并达到恒定值，浴槽内的浓度始终低于计算值，这部分代表了麻药在灌流过程中的损失，占到10-40%。从实验开始稀释母液到最后灌流完成，整个过程中麻醉药的损失是10-50%。整个灌流过程中，浓度高的溶液麻醉药损失程度高于浓度低的溶液。讨论1.刺激性全麻药可以激活迷走神经C-fiber，产生咳嗽、气促、分泌物增多、喉痉挛等呼吸系统并发症；随着浓度升高激活作用越明显，而且异氟烷可以增加C-fibers对capsaicin这类化学刺激的敏感性。2.导致C-fiber兴奋性增高的原因可能与刺激性全麻药直接激活表达于结状神经节和分布于肺组织迷走神经末梢上的TRPA1通道有关；TRPA1的特异性拮抗剂HC-030031可以完全阻断刺激性全麻药对TRPA1的兴奋作用。3.刺激性全麻药虽然不能直接激活TRPV1，但是可以增强TPRV1通道对化学刺激的敏感性。在没有TRPV1的情况下，C-fiber对化学刺激的敏感性下降。本研究揭示了TRPA1是刺激性全麻药产生呼吸系统并发症的主要作用靶点，而TRPV1起到了非常重要的协同作用，两者在气道内的共存是机体对外界刺激做出防御反应的重要因素。七氟烷不能激活TRPA1和TRPV1，更适合用于麻醉诱导和术中维持。