植物甾醇是一种具有生物活性的物质,由于水溶性和脂溶性都不是很好,限制了其应用。通过酶催化的方式,与油酸反应生成植物甾醇油酸酯,它不仅具有植物甾醇与脂肪酸两部分的营养价值,而且改善了植物甾醇的脂溶性和降胆固醇效果,应用范围更广。大豆油脱臭馏出物(SODD)是植物油精炼过程中的副产物,富含游离脂肪酸、植物甾醇、天然维生素E等具有应用价值的物质。因此从大豆油脱臭馏出物中提取出植物甾醇和脂肪酸,并通过酶法合成植物甾醇脂肪酸酯具有重大意义。本实验构建了在非水相中酶法合成植物甾醇酯的反应体系,优化了合成工艺,并对催化酶进行了固定化研究。从大豆油脱臭馏出物中提取出植物甾醇和脂肪酸,根据优化的工艺酶法合成植物甾醇脂肪酸酯,并进行了定性分析。主要研究内容如下:(1)在非水相体系中进行酶促反应,合成植物甾醇酯。分别筛选脂肪酶和有机溶剂介质,实验结果表明,皱褶假丝酵母(Candida rugosa)脂肪酶催化合成植物甾醇酯的酯化率最高;在正己烷中,酶法合成植物甾醇酯的酯化率效果最好。确定了酯化反应的反应体系后,对反应产物进行了薄层色谱分析,在薄层色谱中有新物质生成。对分离纯化后的产物进行红外光谱分析,在1734cm-1处有明显吸收峰,是酯键的特征吸收峰。因此证明反应合成的产物为植物甾醇油酸酯。(2)研究了影响酯化反应的因素,对油酸与植物甾醇的物质的量的比,酶用量,酯化的温度和时间4个因素进行了探讨。经单因素实验考察后,通过甾醇酯化率的响应曲面分析,优化了反应条件:底物摩尔比(油酸/植物甾醇)为3:1,酶用量为底物总质量的7.2%,反应温度为45.3℃,反应时间为25.3h,最优条件下酯化率可达71.95%。(3)采用物理吸附法对CRL脂肪酶(Candida rugosa lipase)进行固定化,以植物甾醇转化率和酶活力为考察指标,实验表明:CRL脂肪酶分别在磷酸缓冲溶液中和有机溶剂正己烷中固定化,前者效果更好;CRL脂肪酶在磷酸缓冲溶液中分别以几种不同载体固定化,进行批式反应,对几种不同固定化酶载体进行筛选,大孔吸附树脂HP-20操作稳定性最好,性能最优。连续反应3次后,酶活力为509.92U/g,酯化反应的酯化率为62.99%,仍有较高的催化能力。(4)研究了溶剂冷却结晶法从大豆油脱臭馏出物中提取出植物甾醇,实验确定最佳提取工艺:丙酮-甲醇混合溶剂的比例为1:2,溶剂原料比为3:1(V/W),养晶时间为18h,洗涤粗甾醇的溶剂为正己烷,洗涤粗甾醇的温度为25℃,洗涤粗甾醇的时间为15min。然后从提取植物甾醇后的滤液中提取出脂肪酸,根据前三章优化好的合成工艺酶法合成植物甾醇酯。通过薄层色谱法鉴定分析,在色谱中有新的物质出现,可初步判定是植物甾醇脂肪酸酯。再通过红外光谱法表征,经红外图谱分析,图中在1737cm-1处有明显的伸缩振动吸收峰,是酯键的特征吸收峰,因此证明了从大豆油脱臭馏出物中提取的植物甾醇和脂肪酸,在非水相中经脂肪酶催化合成的产物为植物甾醇脂肪酸酯。