研究背景与目的:近年来研究发现肿瘤组织中存在一群具有自我更新以及多向分化等一系列正常干细胞特征的细胞,它们具有自己特异表达的分子,这群细胞被命名为肿瘤干细胞(cancer。stem cells or tumor stem cells,CSCs orTSCs)。尽管肿瘤干细胞在肿瘤组织中所占比例很低,但它们具有很强的致瘤性,对放疗、化疗不敏感,是肿瘤复发和转移的根源。SP细胞(side population cell,SP cell,侧群细胞)是利用DNA荧光染料Hoechst33342和流式细胞技术发现的特殊细胞亚群,这群细胞利用细胞膜上的ABC转运子家族蛋白将Hoechst33342泵出细胞,它们具有自我更新、多向分化等一系列干细胞的生物学特征。目前已经在多种正常组织和一些实体肿瘤中分离得到了SP细胞,初步阐明了SP细胞的一系列生物学特征。并非所有的SP细胞都是干细胞,SP细胞只是富含了干细胞,在SP细胞中具有最强泵出Hoechst33342能力的细胞被称为“Tip”-SP细胞,它们富含了最多的干细胞。　　 食管癌(Esophageal carcinoma)是中国的发病率很高的肿瘤,但是迄今为止对食管癌干细胞的研究仍未见报道。本研究拟通过对食管癌细胞系中“Tip”-SP细胞的研究,了解食管癌干细胞的生物学特征,为食管癌的有效靶向性治疗提供新思路。　　 肺癌是世界发病率第一的肿瘤,尽管有文献报道CD133是肺癌的干细胞标记,但目前对其生物学特性仍了解甚少。本研究应用我们首创的原代肿瘤细胞培养新方法建立原代培养的肺癌细胞系,在此基础上分离鉴定肺癌干细胞标记,为深入研究它们的生物学特性打下基础。　　 研究方法:对数生长期的食管癌细胞系用Hoechst33342染色,对比维拉帕米抑制试验,在流式细胞仪上设门Hoechst33342荧光阳性的非SP细胞(non-sidepopulation cell,NSP cell)和荧光阴性/弱阳性的SP细胞群。然后无菌分选收集NSP细胞和荧光表达最弱的“Tip”-SP细胞,研究他们生物学性状的差异,包括对比它们的平板克隆形成能力,分析它们的自我更新和多向分化能力,用Western Blot检测两种细胞中β-catenin蛋白表达的差异。完成一系列的体外试验后我们进行NOD/SCID小鼠体内成瘤实验,观察两细胞亚群在体内的致瘤能力。当确定分离到的“Tip”-SP细胞具有干细胞特征后,我们首先采用免疫荧光方法分析一些常见的干细胞标记在这两细胞亚群间表达的情况。最后我们通过基因芯片检测,寻找这两群细胞间表达差异的基因,并用实时定量PCR(real timePCR,RT-PCR)检测基因芯片结果的准确性。　　 15例新鲜切除的肺肿瘤组织,用胶原酶消化为单个细胞,然后用无血清培养基(serum free medium,SFM)原代培养成功后传代建立为细胞系。将原代培养细胞系接种于NOD/SCID小鼠,鉴定培养的细胞为肺癌细胞。然后通过流式细胞仪分析筛选和免疫荧光分析,寻找可能的肺癌干细胞标记。应用体外增长曲线、克隆形成能力、EMT(表皮细胞向上皮细胞转化)能力、细胞球形成能力及抵抗放射治疗的能力,鉴定应用流失细胞仪分选的细胞为肺癌干细胞。　　 结果：我们发现食管癌细胞系EC-9706和EC-109均含有不同比例的SP细胞。针对来源于EC-9706细胞系的“Tip”-SP细胞我们进行了系列研究,发现这些细胞具有干细胞的一些关键特征。与NSP细胞相比,它们具有较高的平板克隆形成能力(P<0.01),能够分化产生NSP细胞并维持自身的“Tip”-SP的细胞。Western-Blot结果显示“Tip”-SP细胞高表达干细胞重要保守信号通路的转录因子β-catenin。从NOD/SCID小鼠体内成瘤性实验我们发现,“Tip”-SP细胞具有很强的致瘤能力,1000个“Tip”-SP细胞就可以形成肿瘤,而NSP细胞需要至少100,000个细胞才能形成肿瘤,“Tip”-SP细胞的肿瘤形成能力比NSP细胞高出至少50倍。基因芯片结果显示“Tip”-SP和NSP细胞和有168个表达差异基因,其中136个基因在SP细胞中高表达。大部分“Tip”-SP细胞高表达的基因与细胞的转录调控和信号传导相关,部分是已知的干细胞相关基因,少部分差异表达的基因功能目前尚不明确。实时定量PCR验证了基因芯片结果的可靠性,并进一步证实重要的干细胞相关基因SOX-2、OCT-4、BMI-1和ZFX,两个ABC转运子家族蛋白基因ABCG2和ABCA5,3个Wnt信号通路相关基因FZD10、PTGS2和KLF5,两个Norch信号通路相关基因TTK和RBM15在“Tip”-SP细胞中高表达。　　 通过应用我们首创的无血清及相关的培养技术,我们从15个肺癌标本中建立了12个原代培养的细胞系,使肺癌原代培养及建系的成功率达到了80％以上。建立了12细胞系中包括5个肺鳞癌细胞系、4个腺癌细胞系、1个小细胞肺癌细胞系,1个大细胞肺癌细胞系和一个肺类癌细胞系。将建起中的6个细胞系接种于NOD/SCID小鼠3周后,它们均能在小鼠体内形成肿瘤。通过流式细胞仪分析所有的肺癌细胞系均含有一小群标记为CD44++的细胞。流式细胞分选后进行生物学特性研究,发现这群细胞具有较强的增值能力和克隆形成能力,只有它们可以形成holoclone,它们具有间质细胞学的特性,只有它们可以形成细胞球。通过免疫荧光和流失细胞学进一步的分析发现少部分肺癌细胞也表达CD90,CD44++和CD90+细胞较CD44++CD90-细胞具有更强的克隆形成能力和细胞球形成能力,他们抵抗放射线杀伤的能力也最强。这些结果均提示CD44和CD90为肺癌的干细胞标记。　　 结论：1.食管癌细胞系中存在SP细胞。2.首次证实食管癌细胞系中的“Tip”-SP细胞具有肿瘤干细胞的特征。3.我们发明的无血清培养基极大地提高了肺癌细胞原代培养及建系成功率。4.首次证实CD44是肺癌的干细胞标记。5.首次发现肺癌细胞表达CD90,且CD90+细胞富集了较多的肿瘤干细胞。