研究背景和目的近年来,随着现代医学研究的进步,儿童肿瘤的生存率已由10%上升到80%,急性淋巴细胞白血病已由六个月中位生存期上升到80%治愈率。其临床总结主要应归功于治疗方案的改进以及新药的开发。大剂量甲氨喋呤(HDMTX)对髓外防治急性淋巴细胞白血病的有效性已达成共识。其不仅有效防治髓外白血病的发生,且大大提高了ALL患儿的无病生存率。与放疗比较,HDMTX远期疗效好,对患儿的智力和心理行为无不良影响,已经成为现代儿童ALL髓外预防和全身化疗的重要组成部分。然而MTX作为一种细胞周期特异性药物,作用于S期细胞,除了杀灭增生旺盛的肿瘤细胞,对新陈代谢快的消化道粘膜、皮肤等部位的上皮细胞也较为敏感。短时间内大剂量MTX进入体内,抑制肠上皮细胞增殖和上皮细胞功能,增加了感染及败血症的发生。文献报道,正规化疗后,黏膜炎的发生率达40%,大剂量化疗后可高达76%。黏膜炎的发生,不仅增加了病人的痛苦及花费,严重时影响了化疗的进度甚至增加了死亡率。近年来此类报道屡见不鲜。因此如何最大程度减轻HDMTX引发黏膜炎的发生率和严重程度,是目前急需解决的问题。益生菌系一种对人体有益的细菌,主要包括乳杆菌类、双歧杆菌类和革兰氏阳性球菌三大类。作为人体肠道微生态的重要组成部分,参与了宿主的消化、营养、代谢及吸收,并广泛应用于治疗各种消化系统疾病,如新生儿肺炎继发的腹泻、新生儿黄疸、肠易激综合征等。目前研究发现,益生菌能够通过免疫排斥、免疫调节加强胃肠道防御功能,发挥抗炎症的作用。国内外学者研究发现,小鼠溃疡性结肠炎、坏死性小肠结肠炎的早期应用益生菌,可明显降低炎症性细胞因子α-肿瘤坏死因子(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)的表达,从而对炎症起到预防作用。另外,益生菌能够增加肠道局部sIgA的分泌,增强免疫功能,维持肠道的粘膜屏障。化疗所致的黏膜炎的发生机制主要为核转录因子-κB(NF-κB)激活上调基因,产生多种前炎症细胞因子,如TNF-α、IL-1β、IL-6等,诱导克隆原细胞死亡、凋亡和组织损伤。益生菌能否通过干预炎症过程,增强局部免疫屏障,减轻化疗所致黏膜炎的发生,目前鲜有报道。为此我们以HDMTX诱导Wistar大鼠建立黏膜炎模型,检测肠组织TNF-α、肠表面粘液中sIgA、细菌移位等,探讨益生菌对HDMTX诱发黏膜炎的干预治疗机制,以期为临床防治提供理论依据。研究方法Wistar大鼠54只,体重120g-160g,雌雄不限,随机分为3组,A组(n=18)为正常对照组,B组(n=18)为MTX损伤组,C组(n=18)为益生菌干预治疗组。B和C组均腹腔注射MTX1ml(100mg/kg)。A组于d0腹腔注射生理盐水1ml,并于前2天(d-2)开始经口喂食生理盐水2ml,一天两次,直至处死。B组于d0腹腔注射MTX1ml,并于前2天(d-2)开始喂食生理盐水2ml,一天两次,直至处死。C组于d0腹腔注射MTX1ml,并于前2天(d-2)开始经口喂食金双歧一粒,(每粒加入生理盐水中制成2ml混悬液,内含长双歧杆菌活菌≥0.5×10~7CFU,保加利亚乳杆菌和嗜热链球活菌＞0.5×10~6CFU),一天两次,直至处死。三组分别于d1、d3、d5各处死6只大鼠,观察以下指标:1.取空肠近端肠管,制备HE染色的常规病理切片,光镜下观察小肠组织形态学改变,并在100倍光镜下于每张切片中检测10个绒毛高度和10个隐窝深度。2.用免疫组织化学方法观察小肠绒毛中TNF-α的表达:操作按照说明书进行,以细胞膜和(或)胞浆中出现棕黄色颗粒为阳性表达,每张切片随机选取不重叠的10个高倍镜视野(400倍),应用Image-Pro Plus6.0彩色图像分析系统分别计算每高倍镜视野TNF-α的平均吸光度值A,并以此代表TNF-α在肠组织的表达水平。3.Elisa检测肠粘膜SIgA的表达:取靠近回盲部肠管4cm,纵向剖开,生理盐水反复冲洗后,用载玻片轻刮粘膜表面粘液至Eppdeffer管中,然后加入0.01mol/L的PBS液0.5 ml,充分混匀,10000 r/min离心15 min,取上清液-20℃保存待测。4.肠系膜淋巴结细菌培养:无菌条件下摘除肠系膜淋巴结数个称重,将其研磨后取100μl研磨液于血培养皿中培养24h,对培养皿中的细菌进行菌落计数。5.观察各组大鼠的死亡情况。研究结果1、大鼠小肠组织形态学改变以及绒毛高度和隐窝深度正常组大鼠小肠组织无任何病理学改变。损伤组注射MTX后即出现了小肠黏膜炎的表现,以第三天最严重,肠组织结构排列紊乱,绒毛变短变粗,部分脱落,隐窝变浅,甚至消失,大量炎性细胞浸润。第五天病理改变略减轻。益生菌治疗组各时间段均减轻小肠病理改变。MTX损伤组绒毛高度、隐窝深度均明显低于正常对照组,以第三天最低。益生菌治疗组绒毛高度和隐窝深度均明显高于MTX损伤组。2、TNF-α的表达大鼠空肠组织中TNF-α主要表达于肠上皮细胞和固有层中。正常对照组上皮细胞呈中度着色。MTX损伤组第一天大鼠肠上皮细胞染色最强,第三天开始出现明显的细胞坏死及脱落,着色不均匀。益生菌治疗组第1天肠上皮细胞则保持了相对的完整性,染色较MTX损伤组明显减轻,与损伤组比较差异有统计学意义。3、肠粘膜表面SIgA的含量与正常对照组比较,MTX损伤组肠粘膜表面的SIgA的含量明显降低,益生菌治疗组SIgA分泌较损伤组明显升高,两者比较差异有统计学意义。4、大鼠肠系膜淋巴结细菌定量培养正常对照组大鼠肠系膜淋巴结中未发现细菌生长,MTX损伤组大鼠肠系膜淋巴结培养在第一、三、五天均发现菌落,益生菌治疗后细菌培养明显减少。5、各组大鼠死亡情况:试验期间正常组大鼠没有出现非正常死亡的情况,MTX损伤组大鼠因腹泻等化疗副反应死亡7只,而C组大鼠只死亡1只,两组大鼠死亡率的差异有统计学意义。结论1、HDMTX能够诱发大鼠典型黏膜炎的病理改变,用药后第一天即出现明显损伤,第三天最重,表现为小肠绒毛变短变粗,上皮细胞脱落,炎性细胞浸润。2、益生菌主要是通过减少上皮细胞中肿瘤坏死因子的表达,增加SIgA的分泌,减少了细菌移位而明显减轻黏膜炎的病理损伤。3、预防性应用益生菌,能够缩短黏膜炎病程,减少死亡率,为临床应用微生态制剂治疗化疗过程中所产生的副作用提供了理论依据。