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第一部分:忠伦阿汤对CIA大鼠的疗效观察 目的:观察及评价忠伦阿汤对CIA大鼠的疗效。 方法:选用健康成年雄性 Sprague-Dawley(SD)大鼠,随机选取10只作为正常组(normal),其余采用牛Ⅱ型胶原诱导建立胶原诱导性关节炎(CIA)大鼠模型,将造模成功大鼠随机分为模型组(model)、忠伦阿汤高剂量组(zhongl hd)、忠伦阿汤中剂量组(zhongl md)、忠伦阿汤低剂量组(zhongl ld)、甲氨蝶呤组(MTX)和苦参碱组(matrine)。在初次免疫后第11天开始灌胃给药,正常组、模型组予生理盐水灌胃,连续给药6周。观察大鼠体重、足跖厚度、关节炎指数及大鼠踝关节病理学改变。 结果:忠伦阿汤高、中剂量组及苦参碱组可降低CIA大鼠右后足跖厚度及关节指数评分,可缓解关节炎对体重的影响,光镜下观察,模型组大鼠滑膜组织增生明显,大量炎性细胞浸润,软骨破坏,无骨破坏;忠伦阿汤高剂量组显示滑膜组织无增生,炎性细胞浸润少,无软骨侵蚀及骨破坏;忠伦阿汤中剂量组、苦参碱组滑膜组织轻度增生,少量炎性细胞浸润,无软骨侵蚀,无骨破坏;忠伦阿汤低剂量组滑膜组织层增多,炎症细胞浸润明显,局部软骨破坏,无骨破坏。 结论:忠伦阿汤及苦参碱对CIA大鼠有明显的治疗作用。 第二部分:忠伦阿汤对CIA大鼠滑膜细胞凋亡的影响 目的:观察忠伦阿汤对CIA大鼠滑膜细胞凋亡的影响。 方法:大鼠分组给药同第一部分。灌胃6周后,处死大鼠,取膝关节滑膜组织,免疫组织化学法检测滑膜组织中Bax、Bcl-2、caspase-3的表达。 结果:与正常组比较,模型组 Bax、caspase-3表达明显减少,而Bcl-2表达明显增加,而忠伦阿汤和苦参碱可使Bax、caspase-3表达增加,Bcl-2表达减少;与MTX组比较,忠伦阿汤高剂量组Bax、Bcl-2、caspase-3表达无明显差异。 结论:忠伦阿汤及苦参碱能促进CIA大鼠滑膜细胞凋亡。 第三部分:忠伦阿汤对CIA大鼠滑膜细胞JAK/STAT信号通路的影响 目的:观察忠伦阿汤对CIA大鼠滑膜细胞中JAK/STAT信号通路活化及下游cyclin D1表达的影响。 方法:大鼠分组给药同第一部分。灌胃6周后,处死大鼠,取滑膜组织,免疫印迹(Western Blot,WB)方法检测各组滑膜细胞中P-JAK2、P-STAT1、P-STAT3及cyclin D1的表达。 结果:与正常组比较,模型组大鼠 P-JAK2、P-STAT1、P-STAT3及 cyclin D1表达明显增高,而忠伦阿汤和苦参碱可抑制其表达;与MTX组相比,忠伦阿汤高剂量组p-STAT1、p-STAT3表达明显升高,而P-JAK2、cyclin D1表达无明显差异。 结论:忠伦阿汤及苦参碱可抑制CIA大鼠滑膜JAK/STAT信号通路的活化。 第四部分:忠伦阿汤含药血清对体外培养的CIA大鼠FLS增殖凋亡的影响 目的:观察忠伦阿汤含药血清及苦参碱对体外培养的CIA大鼠FLS增殖与凋亡的影响。 方法:CIA大鼠分离、鉴定FLS,采用CCK-8细胞计数法测定忠伦阿汤含药血清/苦参碱的半抑制浓度(IC50),以此作为后续实验浓度。流式细胞仪检测细胞周期。Annexin V-FITC和PI双染法检测细胞凋亡率。WB方法检测大鼠FLS中Bax、Bcl-2、caspase-3及cyclin D1蛋白表达水平。荧光定量实时聚合酶链式反应(qRT-PCR)方法检测大鼠FLS中Bax、Bcl-2、caspase-3 mRNA的表达。 结果:CCK-8法结果显示,忠伦阿汤含药血清和苦参碱呈剂量-时间依赖性的抑制FLS活性,忠伦阿汤含药血清和苦参碱的IC50分别为20%、0.75mg/ml。 模型组Bax、caspase-3 mRNA和蛋白水平、G0/G1期百分比、细胞总调亡率明显降低,Bcl-2、cyclin D1 mRNA和蛋白水平、增殖指数显著升高,提示模型组FLS过度增值(P<0.05);与模型组相比,忠伦阿汤含药血清和苦参碱明显抑制这一过程(P<0.05),苦参碱对Bax蛋白表达无明显差异(P>0.05)。 结论:忠伦阿汤含药血清及苦参碱可抑制CIA大鼠FLS增殖,诱导其凋亡。 第五部分:忠伦阿汤含药血清对体外培养的 CIA大鼠 FLS JAK/STAT信号通路的影响 目的:观察忠伦阿汤含药血清及苦参碱对体外培养的CIA大鼠FLS中 JAK/STAT信号通路活化的影响。 方法:FLS培养,分组同第四部分。采用 WB方法检测细胞中P-JAK2、P-STAT1、P-STAT3蛋白表达,qRT-PCR检测细胞中JAK2、STAT1、STAT3mRNA表达。 结果:与正常组比较,模型组JAK2、STAT1、STAT3蛋白表达明显升高(P<0.05)。当加入 JAK/STAT通路抑制剂AG490时,通路明显被抑制(P<0.05)。忠伦阿汤含药血清和苦参碱能显著下调模型组FLS中JAK2、STAT1、STAT3蛋白水平,抑制JAK/STAT活化(P<0.05)。与AG490组比较,忠伦阿汤含药血清组、苦参碱组JAK2、STAT3蛋白表达明显升高,忠伦阿汤含药血清组STAT3 mRNA表达也明显升高(P<0.05)。 结论:忠伦阿汤含药血清及苦参碱可抑制CIA大鼠FLS JAK/STAT信号通路,抗FLS增殖,促进其凋亡。