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近年来,各种原因导致的急性肝功能衰竭的发病率在逐年升高,由于它起病急,病程发展快,死亡率极高。因此,对急性肝功能衰竭的治疗一直是医学研究亟待解决的问题。以培养肝细胞为基础的生物人工肝技术近年来取得了重要的进展并且已经成为急性肝功能衰竭的有效治疗手段。肝细胞材料的选择是生物人工肝技术中的关键。由于目前常用的猪肝细胞以及人肝肿瘤细胞系不仅与人肝细胞存在较大差异,而且在应用过程中存在排异反应或病毒感染和致瘤性等安全隐患。因此,建立以人源化肝细胞为核心的生物人工肝系统一直是生物人工肝研究和发展的方向。目的:建立永生化人肝细胞系(immortalized human hepatoyte cell line,IHCL),并对它的生物学特性和功能进行分析研究,评价其作为生物人工肝细胞材料的可行性。方法:原代培养的人肝细胞通过SV40 Tag(simian virus 40 large T antigen)和hTERT(human telomerase reverse transcriptase)基因转染,筛选API染色阳性细胞克隆,通过体外扩增建立肝细胞系。通过MTT和流式细胞仪分析IHCL的生长周期。通过细胞接种于裸鼠评价该细胞系的致瘤性。应用RT-PCR检测IHCL中API、CK18、UGT1、GS、GST、HBCF和ALB的mRNA表达。应用免疫荧光染色和Western blot检测IHCL细胞API、UGT1、GS,GST在蛋白水平的表达。应用微载体培养IHCL,MTT法分析细胞生长状态和细胞密度。将IHCL细胞与肝功能衰竭病人的血清/血浆共培养,检测培养前后样本中TB、DB、BUN、LDH水平的变化,评价IHCL的解毒功能。结果:所建立的永生化人肝细胞系具有与原代肝细胞相似的细胞形态和较强的体外增殖活性,细胞已经传代超过80次。晚期传代的IHCL细胞稳定表达SV40 Tag和hTERT基因;细胞以DNA二倍体整数倍方式增殖,细胞倍增周期为38小时;将IHCL接种裸鼠后3个月没有观察到肿瘤生成。RT-PCR证实,IHCL细胞表达API、CK18、UGT1、GS、GST和HBCF的mRNA,免疫荧光染色和Western blot证实IHCL细胞表达API、UGT1、GS、GST基因的蛋白。IHCL细胞可以在微载体上贴附生长,并且可以在96孔板的培养体系中达到2.86×10~6/ml的细胞密度。将IHCL细胞与肝衰竭病人的血清共培养后,样本中TB、DB随培养时间进行性下降,而BUN进行性升高,与共培养前血清中的浓度相比统计学差异非常显著。结论:所建立的永生化人肝细胞系具有正常人肝细胞的基本生物学特性和主要的功能特性,具有作为生物人工肝细胞材料的可行性。