研究背景子宫是女性内生殖系统中的重要器官,尤其是育龄期女性,子宫内膜是一类独特的组织,分为功能层和基底层,任何与子宫内膜基底层相关的损伤会导致上皮再生障碍、瘢痕形成、纤维化[1],严重地影响着女性的月经生理及生殖功能。随着我国计划生育政策的调整,鼓励生育,稳步提高人口数量的国情背景下,因宫腔粘连引发的生育问题日益成为临床研究的重点。研究表明,大面积的子宫内膜的基底层,遭到破坏以后,该局部的子宫内膜几乎不再具有再生功能[2]。但是在临床工作中,我们观察到,一些患者多次诊刮或流产等宫腔操作后也没有发生宫腔粘连,一部分患者仅仅因一次流产手术或宫腔操作就出现了宫腔粘连,从这些现象可以初步判断宫腔粘连的发生是一个复杂的、多因素、多步骤的过程,不单纯是我们看到的表面现象,应该涉及到更深层次的原因,结合以往研究结果,宫腔粘连的发生涉及到炎症因子的释放,基底膜的降解,纤维化的形成等诸多环节,错综复杂。在炎症因子的基础研究中,中性粒细胞浸润主要是由趋化因子介导的,在人类中,由7个ELR chemokine配体与C-X-C结合引发。在CXC家族中,CXCL5是大家关注的一个焦点,以前有研究表明CXCL5是上皮细胞中产生的一种重要的中性粒细胞趋化因子,是粒细胞的强大引诱剂和炎症介质[3-5]。关于组织纤维化的研究中,细胞基质的降解是重要一个环节,目前研究较多的是基质金属蛋白酶家族(MMPs),它在人体多个脏器疾病(如肺、肝脏、肾脏、心脏等)纤维化中的研究,以及恶性肿瘤的基础研究中尤为热门,MMP9是研究者较为青睐的MMPs家族成员之一,它是溶解细胞外基质的主要酶类,可以降解形成基质及基底膜的各种胶原蛋白、蛋白多糖、层连蛋白等成份。在妇产科疾病的基础研究之中,人们研究的重点放在MMP-9/TIMP-1以及MMP其他家族成员/抑制剂在妇科恶性疾病、子宫内膜异位性疾病等的研究[6-8],因为他们都有一些共同的特点,细胞基底膜的突破。目前CXCL5以及MMP-9在宫腔粘连子宫内膜中表达方面的研究很少。目的本课题基于CXCL5炎症因子趋化作用,MMP-9能降解基底膜的多种胶原蛋白,在宫腔粘连的过程中涉及到炎症因子的表达以及纤维化的形成,而且这两个因子位于pi3k通路上的上下游。通过建立实验动物模型,观察CXCL5及MMP-9在动物模型子宫内膜中的表达,以及两者表达情况是否有一定关联。后期收集人宫腔粘连患者子宫内膜标本,对比CXCL5以及MMP-9在人子宫内膜表达的差异情况,并初步探索CXCL5与MMP-9是否存在一定关联,为后续基础实验的继续开展以及宫腔粘连的临床治疗研究提供依据及平台。方法第一部分:通过预实验,确定选取建模动物模型为8周龄成年雌性SD大鼠为研究对象。采用经腹手术方式,子宫腔注入苯酚胶浆法建立大鼠宫腔粘连模型,40只大鼠随机分为三组:IUA组、假手术组及正常组。术后14天,处死大鼠并将组织包埋在标准石蜡中以制备5μm系列切片,动物实验研究材料均采用HE染色,通过Masson染色评价建模效果,免疫组化(IHC)进行检测分析,WB测定CXCL5、MMP-9蛋白水平,qRT-PCR检测CXCL5、MMP-9 mRNA水平。第二部分:收集经临床确诊的宫腔粘连患者12例子宫内膜组织,以及同期的正常对照组12例子宫内膜组织,分析宫腔粘连患者一般资料,通过免疫组化、WB测定CXCL5、MMP-9蛋白水平,qRT-PCR检测CXCL5、MMP-9 mRNA水平。结果第一部分:利用苯酚胶浆法建立大鼠宫腔粘连模型是可行的;通过大体观察,在宫腔粘连大鼠模型中,宫腔粘连组与正常组和假手术组相比,宫腔粘连组大鼠的子宫腔明显狭窄,粘连程度加深;HE染色结果:宫腔粘连模型组子宫内膜腺体数量比正常组和假手术组相显著减少,腺体碎裂并发生溶解,周围充斥着大量蓝染的中性粒细胞,同时还发现胶原纤维替代了巨噬细胞和浆细胞。Masson染色结果显示:正常组粘膜下组织轻度蓝染,假手术组粘膜下组织蓝染程度与正常组相似。IUA组与正常组和假手术组相比,子宫内膜粘膜下组织蓝染面积显著增大,蓝染程度显著加深。免疫组化结果显示大鼠宫腔粘连模型子宫内膜组织的CXCL5阳性表达率明显低于假手术组和对照组,正常组和假手术组大鼠子宫内膜中CXCL5的染色为强阳性表达,MMP-9的阳性表达率明显低于假手术组和对照组;通过WB方法测定CXCL5、MMP-9蛋白表达,宫腔粘连组为低表达,正常组和假手术组为高表达,差异有统计学意义(P<0.01);实时定量PCR检测CXCL5、MMP-9 mRNA表达结果提示:IUA组较对照组mRNA表达水平明显降低,差异有统计学意义(P<0.01)。第二部分:12例宫腔粘连患者中,就诊年龄:24-40岁,中位年龄:29.5岁。按照ESGE分度:Ⅳ度2例,Ⅴa度7例,Ⅴb 3例。就诊前人工流产次数最少的1次,最多的4次,其中1例为足月死产。就诊前总流产次数为24人/次(包含一例足月死产),因稽留流产,后续行人工流产/药物流产+清宫的次数为9人/次。末次妊娠距离就诊时间最长的为10年。按照2015年中华医学会宫腔粘连专家共识标准评分,12例患者评分为18分-28分,中位数:23.2分;人体子宫内膜组织免疫组化结果显示:宫腔粘连患者子宫内膜中CXCL5、MMP-9与对照组相比,为弱阳性表现,差异有统计学意义(P<0.01);Western blot检测结果发现,宫腔粘连组较对照组CXCL5蛋白及MMP-9蛋白表达显著减低,差异有统计学意义(p<0.05);通过实时PCR检测发现,宫腔粘连组较对照组CXCL5、MMP-9的mRNA表达水平明显降低,差异有统计学意义(P<0.01)。结论1.通过苯酚胶浆法建立大鼠宫腔粘连模型简单可行;2.CXCL5、MMP-9在大鼠宫腔粘连子宫内膜中呈低表达状态,CXCL5、MMP-9可能在大鼠宫腔粘连的发展过程有一定的作用,而且两者在大鼠子宫内膜中的表达程度可能存在着一定关联,有待后续扩大样本继续研究,并行可行性分析;3.CXCL5、MMP-9在人宫腔粘连子宫内膜中呈低表达,CXCL5、MMP-9可能参与了宫腔粘连的发展过程,有待后续扩大样本继续研究,并行可行性分析;4.CXCL5和MMP-9在人子宫内膜中的表达存在着某种关联,CXCL5也许会通过Pi3k通路影响着MMP-9,调节MMP-9的表达,参与了宫腔粘连子宫内膜纤维化过程,有待后续继续研究。