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Sabin 株脊髓灰质炎灭活疫苗(Inactivated Poliomyelitis Vaccine,Sabin strain,sIPV)和肠道病毒71型(Enterovirus 71,EV71)灭活疫苗作为近年来刚刚上市的新疫苗,为全球最终消灭脊髓灰质炎和预防控制由EV71病毒引起的小儿手足口病提供了有力的武器。两种疫苗均为灭活疫苗。为提高疫苗的免疫原性,目前主要采用加大抗原使用量和添加疫苗佐剂来提高疫苗的免疫效果。近年来逐渐兴起和普及的微载体培养技术能够有效提高细胞产量,从而提高抗原产量;而氢氧化铝作为传统免疫佐剂能够有效提高疫苗免疫效果,从而减少抗原使用量。这两种物料的应用从不同方面解决了灭活疫苗产能低、价格高的问题,为全球特别是发展中国家使用到廉价、充足的疫苗提供了可能。本文对sIPV灭活疫苗生产中微载体预处理方式对其灭菌温度及Vero细胞贴壁率进行研究并对EV71灭活疫苗生产中氢氧化铝佐剂制备工艺进行优化,旨在为这两种物料的生产制备提供指导,使它们能够更好的应用到sIPV株脊髓灰质炎灭活疫苗和EV71灭活疫苗的生产中,为进一步提高疫苗产量、降低生产成本奠定基础。第一部分:sIPV灭活疫苗生产中微载体预处理方式对其灭菌温度及Vero细胞贴壁率的影响。目前,商品化的微载体多以干粉状态储存和销售,在细胞培养前需要先进行预处理,即用无Ca2+、Mg2+的磷酸盐缓冲液(PBS)对干粉微载体进行水合吸胀和洗涤,然后将水合吸胀后的微载体进行高压蒸汽灭菌处理,之后才能够用于细胞的培养。在这个过程中,可能会对微载体产生影响,从而影响细胞的贴壁和生长。本部分将 Cytodexl 微载体用无 Ca2+、Mg2+的 PBS 以 1:20(50g·L-1)、1:40(25g,L-1)、1:60(16.7g.L-1)三种水合吸胀浓度,每种浓度720ml、2400ml、6000ml三种装量进行预处理,然后置于高压灭菌器中进行121℃高压蒸汽灭菌,观察其水合吸胀浓度及装量差异对灭菌温度造成的影响。灭菌完成后取样对微载体进行显微镜观察,然后将各组微载体样品用于Vero细胞的7L生物反应器培养,12h后记录各组的贴壁率。实验证明,对微载体进行预处理时,不同水合吸胀浓度和装量会对其灭菌时的升温速率造成影响。预处理时水合吸胀浓度不超过50g.L-1 121℃以上灭菌时间不超过212min,对Cytodexl微载体物理特性和Vero细胞的贴壁率没有影响(P＞0.05)。同时,在利用生物反应器培养Vero细胞时,除了考虑微载体的水合吸胀浓度和灭菌温度差异对细胞贴壁率的影响外,更重要的是预处理时不同水合吸胀浓度和装量所造成的灭菌温度差异是否能够满足无菌控制的要求。本部分为sIPV灭活疫苗生产中应用微载体技术培养Vero细胞时预处理的水合吸胀浓度及灭菌温度控制提供了实验依据和建议。第二部分:EV71灭活疫苗生产中氢氧化铝佐剂制备工艺优化采用氨水法制备了6批氢氧化铝佐剂,其中优化前3批,优化后3批。在反应过程中,对氨水的滴加方式进行优化:以450ml/min的速度分8个点向三氯化铝溶液中滴加6%~8%氨水,当pH达到6.0时,将滴加速度降为180ml/min继续滴加,当pH达到6.9±0.1时停止滴加氨水;在透析过程中,对透析方式进行优化:将反应生成的胶体溶液用透析袋分袋包装,每袋装量400ml,放入透析槽,用注射用水流水透析,每天搓揉两次次,间隔6小时。做到每袋搓揉,搓揉时将透析袋底部的沉淀和颗粒充分混合至溶液中,90小时后将所有透析袋中的氢氧化铝佐剂收集至氢氧化铝佐剂配制罐中,在60℃条件下以50Hz的速度搅拌1小时。对优化前后的氢氧化铝佐剂进行粒径检测、沉降分析、铵离子检测、铝含量检测以及本成品的铝吸附效果检测。结果表明:优化后的氢氧化铝佐剂平均粒径显著小于优化前(P<0.05),且平均粒径变异系数小于优化前3批,沉降率均为0ml,铵离子检测合格率100%,铝含量及氢氧化铝含量显著大于优化前(P<0.05),分别提高了 24.7%和26.1%,优化前后6批氢氧化铝佐剂所配制的半成品,其上清液抗原百分含量均≤1.25%,优化后的氢氧化铝佐剂仍能较好的吸附EV71抗原。本部分的优化方式提高了自配氢氧化铝佐剂的质量和安全性,减少了批间差异,其有效性没有因为优化而受到影响。安全、有效的自配氢氧化铝佐剂对于减少对进口商品化氢氧化铝佐剂的依赖、进一步降低疫苗价格创造了条件。