论文部分内容阅读
研究背景:肝癌是威胁人类健康和生命的常见恶性肿瘤之一,其死亡率在肿瘤死亡顺位中位居第三。但肝脏肿瘤药物的治疗选择性和抗性是限制药物疗效的主要问题。药物促进肿瘤细胞凋亡虽然是多途径的,而肿瘤细胞的凋亡过程异于正常的细胞,表现为一系列的癌基因被激活并过表达,这些癌基因表达产物可以直接刺激肿瘤细胞生长,阻断肿瘤细胞的凋亡,同时降低肿瘤细胞对药物敏感性。重建肿瘤细胞的凋亡信号转导系统,促进肿瘤细胞死亡基因的表达或抑制生存基因的作用是我们研发肿瘤治疗药物的又一强有力的靶点。死亡结构域相关蛋白Daxx（the death-domain-associated protein）不仅通过介导Fas-Daxx-JNK凋亡通路,还可作为肿瘤生长因子（TGFβ）信号通路上的下游前凋亡受体来促进细胞凋亡;Daxx可以敏化多种肿瘤细胞的凋亡过程,但对于肝肿瘤细胞株HepG2凋亡的影响尚缺乏文献资料。本试验旨在研究Daxx对人肝癌HepG2细胞药物的敏感性的影响及机制。方法:用脂质体转染法分别转染pEGFP-C1和pEGFP-C1-Daxx这两个载体到HepG2细胞,并建立稳定细胞株,用逆转录聚合酶链反应检测mRNA的表达;实验分组如下:（1）正常对照组（未转染细胞组）;（2）pEGFP-C1空载体转染组（HepG2/ GFP细胞）;（3）pEGFP-C1-Daxx表达载体转染组（HepG2/ GFP-Daxx细胞）。用过氧化氢孵育24小时诱导细胞凋亡,采用MTT法测定细胞活性和流式细胞术检测细胞凋亡率,Western blot分析蛋白的表达。结果:经G418筛选稳定的细胞运用RT-PCR技术分析其mRNA,结果显示转染绿色荧光蛋白Daxx表达载体的细胞Daxx的mRNA明显上调;用荧光显微镜观察到Daxx蛋白主要定位于细胞核。我们用过氧化氢诱导HepG2细胞凋亡,观察到过氧化氢呈浓度依赖性地抑制HepG2细胞活性。正常对照细胞、HepG2/ GFP、HepG2/ GFP-Daxx三组细胞的IC50值分别是0.72、0.76、0.49 mmol/L。并且我们运用流式细胞仪检测到HepG2/ GFP-Daxx组细胞凋亡率明显高于转染空载体质粒组与未转染组（42.9±8.42 VS 27.3±6.38 or 28.5±4.71）。提示HepG2/ GFP-Daxx细胞对过氧化氢的反应性较未转染细胞和HepG2/ GFP敏感。我们还应用western blot检测到活化的caspase3在Daxx转染组细胞表达最强,达到204.66±19.68%,而未转染和HepG2/ GFP组细胞分别是100±3.1%、107.39±20.1%,进一步说明了Daxx可以增加HepG2细胞对于过氧化氢的敏感性。同时我们观察到过氧化氢处理24小时后,Daxx转染组细胞磷酸化的JNK表达明显高于空载体转染组和未转染细胞组。结论:1、Daxx可增加人肝癌HepG2细胞对过氧化氢诱导凋亡的敏感性;2、Daxx蛋白敏化过氧化氢诱导HepG2细胞凋亡可能与协同增加JNK活性有关。