胃癌是全球死亡率第二的恶性肿瘤并且预后不良。胃癌的临床转归受到肿瘤微环境中各种细胞间的调控影响，其中免疫抑制性微环境的形成和持续与胃癌的进展及其治疗效果的不佳直接相关。胃癌实体瘤的细胞组成除了恶变的癌细胞外，还包括肿瘤微环境中固有存在的以及迁移到肿瘤微环境中来的非癌性细胞。在转基因小鼠背景下的肿瘤诱导模型中，最近发现上皮细胞的最初恶性化可以被微环境中的其他非癌性细胞特别是免疫细胞所调控。因此，目前认为，免疫细胞所调控的微环境与肿瘤的生物学活动密切相关，并认为这些免疫细胞很可能将成为肿瘤治疗的靶点。T淋巴细胞是肿瘤微环境中免疫细胞的主要组成部分。近来，在人体肿瘤中发现了一群具有促炎症效应的产IL-17的T细胞。这群细胞又可被进一步分为CD4~+(Th17细胞)和CD8~+(Tc17细胞)的产IL-17的T细胞这两个亚群。在体外，Tc17细胞可在Th17细胞极化相关细胞因子如IL-23的诱导下分化而成；虽然Tc17细胞表现出减弱的细胞毒活性，但在某些小鼠模型中却发挥了对抗流感病毒感染和肿瘤发生的保护作用。另一方面，在猕猴和黑白睑猴等哺乳动物的猴类免疫缺陷病毒感染模型中，Tc17细胞则发挥了促进病程的病理损伤作用。特别值得注意的是，在人胃癌中，Tc17细胞的分布、表型、分化调控及功能机制和临床意义至今尚未明确。单核/巨噬细胞和髓样来源的抑制性细胞是肿瘤微环境中影响抗肿瘤免疫效应的两类重要的免疫细胞类型。单核细胞可以对CSF-1和IL-6等肿瘤诱导的相关信号分子做出反应，并能分泌Th17细胞极化相关细胞因子，继而介导T细胞应答反应。那么，现仍不清楚在胃癌中是否存在着这样一种单核细胞所介导的Tc17细胞分化的调控机制。现认为，髓样来源的抑制性细胞则可直接抑制抗肿瘤免疫应答并促进肿瘤进展。更有趣的是，在小鼠模型中，促炎症细胞因子IL-17可以调控髓样来源的抑制性细胞，但其具体的机制及其在人体肿瘤特别是胃癌中相关机理仍有待阐明。【研究目的】1.明确Tc17细胞在胃癌中的分布和表型特征；2.探讨Tc17细胞在胃癌中的分化发育及其调控机制；3.阐明Tc17细胞在胃癌中的功能机制和临床意义。【研究方法】1. Tc17细胞在胃癌中的分布及表型特征在第三军医大学附属西南医院普外科收集胃癌病人新鲜外周血和组织标本。运用流式细胞术、免疫荧光双染和免疫组化双染检测Tc17细胞的分布情况。H&E染色明确胃组织病理学情况。流式细胞术分析Tc17细胞表型；并分析肿瘤微环境中Tc17细胞与其他免疫细胞的相关性。2. Tc17细胞在胃癌中的分化发育及其调控机制分选同一胃癌病人新鲜外周血单核细胞，正常非肿瘤胃组织及肿瘤组织浸润单核细胞。条件性外周血单核细胞由50%肿瘤细胞系培养上清、肿瘤组织培养上清、正常细胞系培养上清或非肿瘤正常组织培养上清与外周血单核细胞共培养所得。收集单核细胞培养上清和单核细胞用于ELISA和表面标志流式染色检测。在5天的共培养体系中，磁珠分选纯化的外周血CD8~+T细胞先标记上CFSE，再以2比1的比例与同一胃癌病人外周血单核细胞、正常非肿瘤胃组织及肿瘤组织浸润单核细胞，或者肿瘤细胞系培养上清、肿瘤组织培养上清、正常细胞系培养上清或非肿瘤正常组织培养上清作用后的同一病人的条件性外周单核细胞共培养；或者在有重组人IL-6、IL-23和/或IL-1β的条件下与同一胃癌病人外周血单核细胞共培养；或者在有抗人IL-6、IL-23和/或IL-1β中和抗体的条件下与同一胃癌病人的肿瘤组织浸润单核细胞共培养。5天后，收集培养上清和细胞分别用于ELISA和细胞内细胞因子流式染色检测。3. Tc17细胞在胃癌中的功能机制及临床意义分选TNM分期Ⅰ期的胃癌病人原代肿瘤细胞，并用重组人IL-17、IL-22、IFN-γ、IL-17与IL-22组合及100%Tc17细胞分化培养上清刺激；某些培养孔中加抗IL-17和/或IL-22的中和抗体。收集培养上清用于ELISA和趋化试验。收集刺激后的肿瘤细胞培养上清作为趋化吸引液。流式分选的肿瘤浸润的髓样来源的抑制性细胞置于Transwell板的上室。趋化因子CXCL12和趋化吸引液置于下室。通过计算下室中和附着于通透膜底部的细胞数量总和来评价细胞的迁移变化。在某些情况下，事先将髓样来源的抑制性细胞与抗CXCR4的中和抗体孵育后再进行趋化实验。纯化的外周CD8~+T细胞用CFSE标记后再与同一胃癌病人的同样数量的去除CD8~+T细胞的外周血单个核细胞(事先用丝裂霉素C处理)共培养。再在上述培养体系中以1比1比例加入流式分选所得的同一胃癌病人的肿瘤组织浸润的髓样来源的抑制性细胞。在Transwell实验中，CFSE标记的CD8~+T细胞与裂霉素C处理的饲养细胞以1比1的比例置于下室，同一胃癌病人的肿瘤组织浸润的髓样来源的抑制性细胞则置于上室或者下室。培养5天后，收集培养上清和细胞分别用于ELISA和流式染色检测。胃癌病人总生存率以手术当天算起，直到死亡或者最后一次随访。累计的生存时间用Kaplan-Meier方法计算。总生存率的各类预后影响因子的多变量分析用Cox比例危险率模型进行分析。【研究结果】1. Tc17细胞在胃癌中的分布及表型特征1.1胃癌病人外周血中Tc17细胞百分率较正常人外周血的显著增高。就胃癌病人本身，肿瘤组织中Tc17细胞百分率较其他组织显著增高。随着肿瘤进展，Tc17细胞百分率在各个组织(肿瘤引流淋巴结除外)中均显著增高。就肿瘤组织而言，Tc17细胞从Ⅱ期肿瘤以后则随着分期进展逐渐增高。如以每1,000,000个总细胞中Tc17细胞的绝对数量来统计分析，也得到上述相同的结论。1.2通过免疫荧光和免疫组化双染发现，Tc17细胞在肿瘤组织明显浸润。上述结果提示，Tc17细胞在胃癌微环境中浸润增高。1.3胃癌组织中浸润的Tc17细胞基本不共表达IFN-γ、IL-4、 IL-10或IL-9等细胞因子，但共表达IL-22及IL-17F；肿瘤内Tc17细胞也不共表达HLA-DR或CD25等与T细胞激活相关的表面分子，亦不共表达perforin或GrB等与细胞毒效应和FoxP3或PD-1等与免疫调节或免疫抑制相关的分子。肿瘤组织、癌旁组织及正常非肿瘤胃组织浸润的Tc17细胞表现出CD27-CD45RA-效应/记忆型，肿瘤引流淋巴结和外周血Tc17细胞则分别表现出CD27~+CD45RA-记忆型和CD27~+CD45RA~+初始型。在肿瘤微环境中，Tc17细胞与产IL-22的T细胞、Th17细胞及CD14~+肿瘤相关单核细胞成正相关，而与其他T细胞亚群及CD56~+自然杀伤细胞则无明显相关性。2. Tc17细胞在胃癌中的分化发育及调控机制2.1T细胞-单核细胞共培养实验证实，相比外周血单核细胞和正常非肿瘤胃组织浸润的单核细胞，肿瘤相关单核细胞可以显著诱导外周CD8~+T细胞向Tc17细胞分化和IL-17产生，并能促进CD8~+T细胞增殖。此外，肿瘤相关单核细胞表面CD80、CD86和HLA-DR等共刺激分子的表达也较外周血单核细胞和正常非肿瘤胃组织浸润的单核细胞显著增高。2.2相比正常细胞系培养上清和非肿瘤正常组织培养上清作用后的外周单核细胞，肿瘤细胞系培养上清及肿瘤组织培养上清作用后的外周单核细胞显著高表达CD80、CD86和HLA-DR等共刺激分子，并能显著诱导外周CD8~+T细胞向Tc17细胞分化和IL-17产生，并能促进CD8~+T细胞增殖。上述结果提示，肿瘤微环境可以激活其中的单核细胞，后者进而诱导Tc17细胞分化。2.3相比外周血单核细胞和正常非肿瘤胃组织浸润的单核细胞，肿瘤相关单核细胞培养上清中IL-6、IL-1β和IL-23的水平显著增高。相比正常细胞系培养上清和非肿瘤正常组织培养上清作用后的外周单核细胞，肿瘤细胞系培养上清及肿瘤组织培养上清作用后的外周单核细胞的培养上清中IL-6、IL-1β和IL-23的水平亦显著增高。在外周CD8~+T细胞与肿瘤相关单核细胞的培养体系中，单独或者联合使用抗IL-6、IL-1β或/和IL-23抗体阻断其生物学功能后，Tc17细胞分化和IL-17产生水平则明显降低。在外周CD8~+T细胞与外周单核细胞的培养体系中，单独或者联合使用重组IL-6、IL-1β或/和IL-23增强其生物学功能后，Tc17细胞分化和IL-17产生水平则明显增高。上述结果提示，IL-6、IL-1β或/和IL-23在体外单核细胞诱导的Tc17细胞分化调控中发挥了重要作用，并进一步提示在体内Tc17细胞分化存在相似的调控机制。3. Tc17细胞在胃癌中的功能机制及临床意义3.1相比癌旁组织和非肿瘤正常组织，髓样来源的抑制性细胞在CD45~+细胞中的百分率在肿瘤组织则明显增高，并与Tc17细胞百分率成正相关。同时，肿瘤组织浸润的髓样来源的抑制性细胞基本不表达IL-17受体、趋化因子受体CCR4、CCR6或CXCR3，但却高表达趋化因子受体CXCR4。相反，癌旁组织和非肿瘤正常组织中表达CXCR4的髓样来源的抑制性细胞则相对显著降低。上述结果提示，髓样来源的抑制性细胞很可能是通过CXCR4介导的趋化作用浸润到肿瘤微环境中。3.2在肿瘤组织内Tc17细胞与CXCR4的配体即趋化因子CXCL12成正相关；胃癌肿瘤细胞则高表达IL-17受体，IL-17能剂量依赖性刺激诱导肿瘤细胞产生CXCL12。肿瘤相关单核细胞与CD8~+T细胞衍生的Tc17细胞培养上清(而非外周血单核细胞和正常非肿瘤胃组织浸润的单核细胞与CD8~+T细胞衍生的培养上清)同样也能诱导肿瘤细胞产生CXCL12，这种诱导效应可以被抗IL-17中和抗体所阻断。上述结果提示，Tc17细胞产生的IL-17能诱导肿瘤细胞产生趋化因子CXCL12。3.3髓样来源的抑制性细胞趋化实验显示，相比外周血单核细胞和正常非肿瘤胃组织浸润的单核细胞与CD8~+T细胞衍生的培养上清所刺激的肿瘤细胞的培养上清，肿瘤相关单核细胞与CD8~+T细胞衍生的Tc17细胞培养上清所刺激的肿瘤细胞的培养上清能显著诱导髓样来源的抑制性细胞趋化，这种诱导效应可以被抗IL-17中和抗体或者抗CXCR4中和抗体所阻断。上述结果提示，Tc17细胞产生的IL-17能诱导肿瘤细胞产生趋化因子CXCL12，后者可以进而趋化髓样来源的抑制性细胞到肿瘤微环境中。3.4髓样来源的抑制性细胞可以抑制CD8~+T细胞增殖、IFN-γ的产生和perforin/GrB的表达。Transwell实验显示，髓样来源的抑制性细胞的这种抑制效应是通过细胞间相互接触而发挥的，表明髓样来源的抑制性细胞通过细胞间相互接触的机制发挥了抑制CD8~+细胞毒性T细胞的抗肿瘤作用。3.5Tc17细胞百分率与癌胚抗原的表达、淋巴管的侵袭和血管的侵袭正相关。通过Tc17细胞百分率的中位数(2.75%)把胃癌病人分为2组，21月为随访周期的生存分析显示，高Tc17细胞百分率的病人组的生存率显著低于低Tc17细胞百分率的病人组。如以Tc17细胞绝对数来统计分析也可得到相同的结论。更重要的是，运用Cox比例危险率模型的多变量分析来评估总生存率的各类预后影响因子揭示，肿瘤内Tc17细胞百分率可以独立预测胃癌病人的预后及生存。【结论】1. Tc17细胞，具有自己独特的细胞因子和生物学功能分子的表型表达谱，主要在胃癌病人的肿瘤组织中浸润。2.肿瘤激活的单核细胞分泌IL-6、IL-1β和IL-23，进而诱导调控Tc17细胞分化。3. Tc17细胞的分化上清可以诱导肿瘤细胞产生趋化因子CXCL12，后者通过与CXCR4作用促进髓样来源的抑制性细胞趋化，髓样来源的抑制性细胞又通过细胞间相互接触的机制发挥抑制CD8~+细胞毒性T细胞的抗肿瘤作用。4.肿瘤内Tc17细胞百分率与胃癌的进展密切相关并可以独立预测胃癌病人的预后及生存。【意义】本文探讨了Tc17细胞在胃癌中的重要意义，深入研究Tc17细胞在胃癌微环境中的调控机制和功能作用，将有助于我们更全面认识胃癌的免疫应答规律及Tc17细胞在胃癌微环境中的免疫病理机制，并提示靶向Tc17细胞可能成为胃癌免疫治疗的新手段。