土壤杆菌(Agrobacterium)是主要的土壤细菌类群,该属的部分菌种具有砷氧化及促进植物生长等特性。砷(Arsenic, As)是一种剧毒的类金属,在自然界中的主要无机形态为亚砷酸盐[Arsenite, As(Ⅲ)]和砷酸盐[Arsenate, As(Ⅴ)] 。细菌砷氧化[As(Ⅲ) oxidation]是利用细菌砷氧化酶(Arsenite oxidase, AioBA)将As(Ⅲ)氧化为As(Ⅴ)的一种微生物解毒机制。但自然界中的部分微生物还可以将砷氧化作为一种能量来源支持自身生长。作为磷酸盐(Phosphate, P)的化学类似物,As(Ⅴ)是否能够取代P来支持微生物的生长是目前科学界高度关注的问题。本课题利用分子生物学、细菌-植物联合修复和基因组学等手段,对土壤杆菌的砷氧化、砷磷替代机制、细菌-杨树联合修复含砷土壤和基因组分析等科学问题进行了研究,主要结果如下：一、土壤杆菌砷氧化与砷替代磷的偶联机制为研究砷氧化对细菌生长的影响,阐明微生物中砷利用的机制和可能性,并确定砷在细菌细胞中的分布和含砷生物大分子的存在,以及砷氧化释放的能量在异养型砷氧化菌中的利用情况,以Agrobacterium tumefaciens GW4为材料,得到了以下结果：1.本研究中,在低磷(培养基中含有0.1mmol/L P)或正常磷(培养基中含有1 mmol/L P)条件下,As(Ⅲ)氧化能够促进细菌GW4的生长。敲除砷氧化酶大亚基基因aioA的突变株丧失了As(Ⅲ)氧化能力,同时也丧失了As(Ⅲ)的促长作用,互补株同时回复了氧化能力和促长作用。此外,检测细胞内外As含量,发现在含As(Ⅲ)的低P条件下,野生株和互补株氧化As(Ⅲ)的氧化率为100%,而在细菌后期培养中发现,细胞内存在As(V),野生株和互补株对As(Ⅴ)的吸收率分别为50%和30%,而突变株细胞内无As。同时在含有As(Ⅴ)的低P条件和含有As(Ⅲ)的高P条件下,三株细菌细胞内均无As(Ⅴ)存在。2.在低P或正常P条件,加入As(Ⅲ)时,野生株和互补株中NADH和ATP的含量都随着As(Ⅲ)氧化过程大量增加。而突变株中NADH和ATP的含量无明显增加。虽然整个过程的分子机制及电子传递路径还需进一步研究,但该结果仍表明As(Ⅲ)氧化确实能够产生ATP供给细胞生长,是As(Ⅲ)对细菌促长作用的机制之一。3.本研究在含As(Ⅲ)的低P条件下检测了细菌的碱性磷酸酯酶(Alkaline phosphatase, APase)活性及磷酸盐结合蛋白(Phosphate binding protein, PstS)的盐离子结合能力。结果发现,在低P情况下,APase活性升高,制造活性P保证DNA、RNA、糖类及能量物质的正常代谢,同时造成蛋白质和脂类中的P缺失。为了弥补这种P缺失,砷氧化酶AioBA氧化As(Ⅲ),由PstS结合氧化生成的As(V)运输进入细胞内。细胞内的As(Ⅴ)被酶类错误识别为P,参与蛋白质和脂类的化学构成,形成含砷的蛋白质与脂类。而后,含砷脂类构成砷脂双分子层参与细菌的细胞膜构建,导致细菌细胞形态改变。该结果证明细菌可以利用As(Ⅴ),并且是AioBA、APase和PstS协同作用的结果。4.研究中,野生株吸收了约1.3 mmol/g As(V),这些As(V)规律分布于细胞各部分。在细菌的DNA、RNA和糖类中没有检测到As(V),而在蛋白质和脂类中分别含有0.4士0.01和0.4±0.03 mmol/g As(V)。该结果表明在含As(Ⅲ)的低P条件下,细菌利用了约0.8 mmol/g As(V)和0.3 mmol/g P。而在正常P条件下,无论加As与否,细菌都利用了约1.3 mmol/g P,这与低P条件下细胞利用的As(V)和P的总和(1.1 mmol/g)基本相等。该结果说明低P条件下,As(V)替代P支持细胞生长,是促长作用的另一机制。本研究证明了细菌GW4中As与P的物质代谢和能量代谢。As(Ⅲ)氧化能够促进A. tumefaciens GW4的生长。具体机制为：1)在低P和正常P条件下,As(Ⅲ)氧化释放的能量都能够促进细菌生长。2)当细菌GW4处于低P加As(Ⅲ)条件时,碱性磷酸酯酶APase制造活性P,用来维持DNA、RNA、糖类及能量物质的正常代谢,造成脂类和蛋白质上的P缺失。砷氧化酶AioBA氧化As(Ⅲ),再由磷酸盐结合蛋白PstS结合生成的As(V)转运进细胞内。在细胞内活性P不足情况下,酶将As(V)错误识别为P,形成含As的蛋白质和脂类。而含砷脂类形成砷脂双分子层构建细胞膜。3)低P条件下细胞吸收并利用的As(V)和P的总量与正常P条件下细菌生长所用的P总量基本一致。二、土壤杆菌促进植物修复砷污染土壤的效率本课题的目的是研究杨树与一株Agrobacterium联合使用的土壤砷去除效果。结果如下：本研究在蜈蚣草根际土壤中分离得到一株细菌D14,并将其归属于Agrobacterium radiobacter。该细菌具有较强砷抗性和砷氧化性,同时可以合成吲哚乙酸(IAA)和铁载体(siderophore)。杨树是高效的砷富集植物,但是其生长受砷的抑制。在300 mg/kg砷浓度条件下(高砷土壤),与无菌处理相比,接种了细菌D14后,土壤中54%的砷被植物吸收,远远高于无菌处理(43%)。并且,植物根、茎、叶中的砷浓度分别提高了228.5%、112.4%和290.7%；而且,砷在植物中的迁移率为0.8,明显高于无菌处理(0.5)。此外,植物的生长参数和各项生理生化指标均表明其对砷的生长抗逆性增强。以上结果显示A. radiobacter D14可能具有：(1)降低土壤中砷毒性,促进植物生长；(2)提高植物砷富集能力；(3)增强土壤中砷的生物活性,促进砷从土壤中向植物地上组织转运的能力。三、土壤杆菌C58的基因组基因注释修正和实验验证Agrobacterium tumefaciens C58能够在双子叶植物中介导植物肿瘤的发生,本研究利用Z曲线原理将A. tumefaciens C58的基因组进行了重新注释。结果显示,在细菌C58基因组的’hypothetical genes’中共发现了29个非编码读码框(open reading frames, ORF)。然后利用反转录PCR技术(reverse transcription-PCR, RT-PCR)对不同生长时期的细菌进行实验验证,发现理论预测的正确率为79%。此外找到19个新的蛋白质编码基因。通过实验验证,理论预测的正确率同样为79%。实验验证结果说明本研究中的理论预测正确率较局。由于A. tumefaciens C58是最常用的植物转基因工程菌,因此对该菌基因组的重新注释可以为植物转基因技术提供理论基础和支持。本论文结合土壤杆菌属中不同特性的菌种分别进行了砷磷替代、土壤砷污染修复和基因组重新注释的研究。为土壤杆菌的理论研究和应用性提供了可靠并具备创新性的实验数据。