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板栗壳是板栗(Castanea mollissima Bl.)加工过程中产生的下脚料，目前以焚烧和填埋为主，不仅对环境造成不良影响而且浪费了宝贵的资源。本研究室发现板栗壳中富含原花青素(procyanidins from chestnut shell，简称CSPCs)，证实CSPCs具有清除自由基和抗氧化以及抗肿瘤等生物活性，并发现CSPCs体外除了可诱导肿瘤细胞凋亡性死亡外还存在另一种死亡方式，即自噬性死亡。基于此本论文以人肝癌HepG2细胞为模型，采用形态学、生化和分子生物学等技术和方法，探讨CSPCs诱导人肝癌HepG2细胞自噬性死亡的作用及其分子机制。在此基础上，研究CSPCs诱导人肝癌HepG2细胞自噬和凋亡之间的相关性，进而揭示CSPCs诱导HepG2细胞死亡的途径和分子机制。具体研究内容和结果如下: 1.CSPCs诱导HepG2细胞自噬性死亡及其分子机制 通过MTT法检测CSPCs对HepG2细胞增殖的影响;利用MDC染色、GFP-LC3质粒转染、透射电镜观察自噬小泡的形成与结构;检测活性氧的产生、线粒体膜电位变化、细胞周期变化，研究CSPCs诱导HepG2细胞自噬性死亡作用;通过western blot检测自噬相关蛋白表达，研究CSPCs诱导HepG2细胞自噬的分子机制。结果如下: (1)CSPCs对HepG2细胞增殖的抑制作用具有时间和剂量依赖效应。CSPCs作用HepG2细胞6～120 h，抑制细胞增殖的ICs0在(157.5±0.57)μg/mL和(84.55±0.4)μg/mL之间。 (2)通过形态学和生化指标分析表明，CSPCs能够诱导HepG2细胞发生白噬，其最佳作用时间和剂量分别为12h和300μg/mL;经形态学观察能清晰看到自噬小体和LC3自噬蛋白荧光以及自噬小泡的结构;western blot检测发现LC3蛋白表达增加，当使用自噬抑制剂3-MA预处理细胞后，自噬受到抑制。 (3)CSPCs可以诱导HepG2细胞阻滞于S期，并能诱导线粒体膜电位下降，用自噬抑制剂3-MA预处理细胞后，这些现象都得到缓解。CSPCs作用HepG2细胞后活性氧(reactive oxygen species，简称ROS)产生量显著增加，并存在剂量依赖性。用ROS的抑制剂N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine，简称Nac)预处理后，自噬受到抑制，细胞的存活率得到提高。CSPCs诱导HepG2自噬性死亡可能依赖于ROS的产生能力，并且与线粒体途径有关。 (4)PI3K/AKT/mTOR信号通路参与了CSPCs诱导的HepG2细胞自噬过程。在检测PI3K/AKT/mTOR相关蛋白和Beclin1蛋白时发现p-AKT，mTOR，PI3K的蛋白表达随CSPCs剂量依赖性下调，Beclin1的蛋白表达随CSPCs剂量依赖性上调。说明该自噬经典的分子信号通路参与了HepG2细胞自噬过程。 2.板栗壳原花青素诱导HepG2细胞自噬和凋亡相关性研究 通过MTT实验检测自噬抑制剂3-MA和凋亡抑制剂Z-VAD对150μg/mLCSPCs作用HepG2细胞48 h增殖的影响;利用MDC染色、GFP-LC3质粒转染检测48 h时CSPCs诱导HepG2细胞自噬效果;通过形态学和生化指标检测细胞核固缩和细胞凋亡，研究自噬对凋亡的影响;通过western blot检测自噬相关蛋白和线粒体相关蛋白表达，研究CSPCs诱导肿瘤细胞白噬和凋亡关系内在的分子机制。结果如下: (1)自噬抑制剂3-MA和凋亡抑制剂Z-VAD预处理后CSPCs对肿瘤细胞的增殖均有抑制作用，且均能削弱自噬作用。 (2)通过形态学和生化指标分析显示细胞核发生聚缩和裂解，产生“凋亡小体”，流式细胞仪检测凋亡细胞增多，细胞发生凋亡。当用3-MA和Z-VAD预处理后凋亡现象均得到抑制。表明自噬对凋亡具有一定影响。 (3)3-MA可以抑制PI3K，p-AKT和mTOR蛋白的表达量的下调。这表明下调PI3K/AKT/mTOR信号通路蛋白可以促进CSPCs诱导HepG2细胞自噬，当LC3-Ⅱ si-RNA转染HepG2细胞时发现，对LC3-Ⅱ蛋白表达的抑制能有效抑制凋亡相关蛋白caspase3的表达，表明CSPCs在作用HepG2细胞时增强自噬可促进凋亡。通过检测Bcl-2家族蛋白发现，3-MA和Z-VAD均能抑制Bcl-2蛋白表达的下调和Bad和Bax蛋白表达的上调，表明线粒体相关蛋白参与了自噬和凋亡调控过程。