研究背景骨肉瘤作为一种在儿童和年轻人中最常见的恶性骨肿瘤,血运丰富且高度恶性,预后很差。虽然已经使用了新辅助化疗和保肢手术相结合的方式,总的5年无瘤生存率仍仅有65%。传统的临床预后因素虽然很好的回答临床预后问题,但是其缺乏统一标准、测量方式不一致等局限性限制了其进一步的发展。随着对肿瘤发生过程中分子路径多样性的认识不断深化,分子预后指标逐渐成为临床判断预后的发展方向。其中已经有相当一部分(主要是P-glycoprotein,CXCR4,uPA/uPAR和survivin)已经被证实可以很好的判断对化疗的反应、总的预后和诊断转移,同时也为各种新的治疗药物的产生提供信息和新的靶点,从而为临床判断临床预后提供了新的指标。RECK (reversion-inducing cysteine-rich protein with Kazal motif)基因是1998年Takahashi等在v-Ki-ras基因转染的小鼠的纤维原细胞(NIH3T3)表达的cDNA中分离得到的,位于人9p13-p12染色体,整个基因的长度在87kb,编码GPI锚定糖蛋白,分子量为110kb,具有抑制基质金属蛋白酶表达及活性的功能,进而能够很好的抑制肿瘤的侵袭和转移。同时,RECK具有很好的抑制血管生成和成熟的作用。RECK的缺失对于小鼠胚胎发育是致命的,而金属基质蛋白酶抑制剂TIMP-1或-2的缺失几乎无影响,这表明了在胚胎发育过程中RECK基因较任何一种TIMP作用都大。尽管诸多实验已经正式RECK有可能对恶性肿瘤的诊断及治疗起着重要作用(腺癌、结肠癌、非小细胞肺癌、前列腺癌、乳腺癌、胰腺癌等),但是对于其在骨肉瘤中的表达情况却少有报道。唯一的一项研究显示RECK在骨肉瘤中显示出低表达,并在骨肉瘤转移中起重要作用,其低表达往往预示预后不佳,同时在体外也很好的证实了具有抑制转移的功能。本项研究通过免疫组化技术检测我院2001年2月-2005年7月61例骨肉瘤组织的RECK的表达情况,并结合病人的临床病理特点,探讨RECK表达情况与骨肉瘤预后的关系,同时探讨可能的机制,进而为骨肉瘤的治疗方法的选择提供依据,也为各种新的骨肉瘤治疗药物的产生提供信息和新的靶点。目的1.探讨RECK在骨肉瘤组织中的表达情况；2.探讨RECK表达与骨肉瘤预后之间的关系；材料与方法1.病例资料病例资料均取自我院骨科2001年2月-2005年7月术中切取的经我院病理科明确诊断为骨肉瘤的病人。其中男性42例,女性19例；年龄4-53岁,平均年龄21.4岁。其中病变部位位于股骨远端28例；胫骨近端30例；肱骨近端1例；腓骨近端1例；骨盆1例。所有病人在术前均接受了术前2次化疗和术后6次化疗治疗。化疗方案参照T12方案,简单的概括为：每个周期的化疗包括高剂量的甲氨喋呤、阿霉素、顺铂、异环磷酰胺。随访周期定义为首发症状到死亡或者最后一次随访的间隔时间。随访周期为8-104月。1.1病例入选标准1)肢体恶性骨肉瘤；2)首发时均无转移灶；3)没有先前治疗病史；4)术前、术后均接受了完整化疗治疗；5)均接受了广泛或根治性切除术；6)所切取的标本均可以用于免疫组化检测。1.2病例排除标准1)未接受全程标准化治疗的患者2)化疗前胸部平片证实有肺转移者3)接受化疗后因化疗副反应而终止治疗者4)未完成标准化疗治疗的患者2.主要试剂及工作浓度2.1 RECK兔抗人多克隆抗体,H-300, Santa Cruze公司,工作浓度为1：502.2抗鼠/兔通用型免疫组化检测试剂盒(ChemMateTMEnVisio+/HRP/DAB Rb&Mc) DAKO公司产品2.3.1适用性一抗为兔抗或鼠抗的免疫组化检测2.3.2原理试剂盒是一个特别敏感的二步法免疫组化试剂盒,适合于兔抗抗体或鼠抗抗体配用。其中ChemMateTMEnVisio是标记有HRP(辣根过氧化物酶)和抗兔及抗鼠免疫球蛋白的多具体分子,相当于二抗,它与兔抗或鼠抗一抗结合。结合后的大分子即标记偶辣根过氧化物酶,再与DAB(3,3,-二氨基联苯胺)反应,得到棕色显色。由于该系统不含有生物素和链亲和素,所以不受内源性生物素干扰。染色背景非常清晰。3.免疫组化方法3.1组织切片、烤片每例骨肉瘤组织石蜡标本连续切片3张,厚4-μm,在60℃烤箱中烘烤1-2小时3.2切片脱蜡水化将厚度为4-μm已在烤箱中干燥后的石蜡切片浸于二甲苯中10分钟,三次。取出切片置于100%无水乙醇中10分钟两次,一次置入90%-70%各级酒精各10分钟。取出置于蒸馏水中水洗。3.3抗原修复石蜡切片高压抗原修复操作方法：将1500ml～3000ml的枸橼酸盐缓冲液注入不锈钢压力锅中加热至沸腾。切片置于金属架上,放入锅内,使切片位于液面一下,盖锅压阀。当压力锅开始慢慢喷气时(约加热5-6分钟后),及时1-2分钟,然后将压力锅端离热源,冷水冲至室温后,取下气阀,打开锅盖取出切片,置于蒸馏水中洗。3.4过氧化物酶阻断Quechua蒸馏水中的切片,甩掉并擦干切片组织周围的液体,平放于湿盒中,滴加过氧化物酶阻断剂(3%过氧化氢)于组织上避光孵育5-20分钟。蒸馏水冲洗,再将切片置入PBS缓冲液中,浸泡5分钟,三次。取出切片,甩掉并擦干组织周围的液体,平放于湿盒中。3.5滴加一抗滴加50-100微升一抗工作液于组织上,室温孵育30分钟。用PBS液冲洗切片。将切片置于PBS缓冲液中,浸泡5分钟,三次。取出切片,甩掉并擦干组织周围的液体,平放于湿盒中。3.6滴加二抗(ChemMateTMEnVisio+/HRP)滴加50-100微升A液(ChemMateTMEnVisio+/HRP)于组织上,室温孵育30分钟。用PBS液冲洗切片。将切片置于PBS缓冲液中,浸泡5分钟,三次。取出切片,甩掉并擦干组织周围的液体,平放于湿盒中。3.7滴加显色剂(DAB)滴加预先准备好的显色剂DAB工作液50-100微升,孵育2-30分钟,在光学显微镜下控制显色,显色完全后,用蒸馏水冲洗终止显色。3.8复染、脱水、封片用苏木精复染。各级酒精(70-100%)脱水,每级10分钟。取出切片置入二甲苯10分钟,三次。用中性树胶封片。用磷酸盐缓冲液(PBS)代替一抗作为阴性对照。4. RECK在骨肉瘤组织中的表达染色结果判断标准RECK蛋白阳性信号呈棕黄色颗粒样物质,位于细胞浆内。高倍镜下随机选取5个视野(每个视野观察细胞数不少于200个),按阳性细胞所占百分比及着色深浅进行结果判定。采用9分评分制：按照阳性细胞比例：无染色0分≤10%为1分,10%-50%为2分,>50%为3分；按染色强弱：阴性为0分；淡黄色染色为1分；中度黄色染色为2分,棕黄色染色<为3分。基于此,计算两种评分系统的得分总和,总分≤4为阴性组,总分>4为阳性组.5统计学分析数据采用SPSS 13.0软件进行统计学处理,各组之间阳性表达率比较用x2检验。用Kaplan-Meier方法计算生存率,组间生存率的比较采用log-rank检验。通过单因素分析检测可能的临床预后因素,并通过COX回归分析(采用逐步回归法,纳入变量的标准为P<0.05,剔除标准为P>0.10)进一步检测预后的影响因子。检验水准为α=0.05.6.结果6.1 RECK在骨肉瘤组织中的表达情况在骨肉瘤组织中,RECK主要表现为在骨肉瘤细胞的细胞质中呈现为棕黄色大小不等的颗粒样物质。6.2 RECK与临床相关特点之间的关系基于RECK表达的比例及密度评分的综合,将病人分为阳性表达组34人(55.7%),阴性表达组27人(44.3%)。通过统计分析发现RECK表达与转移(P=0.003)及复发(P=0.001)有明显相关性,而与年龄、性别、肿瘤部位及分型未见明显统计学意义。6.3 RECK与临床预后及生存率之间的关系单因素分析显示RECK表达与是否转移、复发、Ennecking分期及细胞坏死率有关。RECK阳性组生存率为82.4%,明显高于RECK阴性表达组(29.6%；P=.000)。为了确切评估RECK对骨肉瘤预后的作用,采用多因素分析可能有意义的变量。研究发现RECK表达可以作为骨肉瘤预后的一个独立预后因素(P=.006；HR,0.253; 95% CI,0.095-0.676)。7.结论：1. RECK在骨肉瘤组织中广泛表达,且其表达与骨肉瘤的是否转移、复发、Ennecking分期及细胞坏死率有关。2.本组研究结果证实RECK可作为预测骨肉瘤复发、转移及预后的重要参考指标,同时也为个体治疗方案的选择提供重要依据。