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研究背景在过去的数十年内，哮喘在世界范围内发病人数有一定的上升，尤其是高收入国家。人类对支气管哮喘的发病机理有了更深入的认识，哮喘治疗手段也日益增多，但哮喘的发病率和死亡率并没有明显下降。相反，在许多国家哮喘的发病率和死亡率不降反升，成为人类健康的严重威胁。近年来研究表明，辅助性T细胞（Th）Th1/Th2功能失衡，Th2活化亢进在哮喘发病机制中起重要作用。哮喘患者体内Th0向Th2分化过度，Th2细胞产生多种细胞因子如IL-4、IL-5及IL-13等促进过敏原特异性IgE的合成，介导骨髓嗜酸性粒细胞分化、成熟及向肺组织趋化，促进气道黏液分泌和气道高反应性，从而导致哮喘的发生。卡介苗（BCG）是结核分支杆菌减毒活疫苗，是一种很强的Th1免疫反应刺激剂，能纠正Th1/Th2失衡。目前为止，以动物进行的研究均显示BCG接种能明显抑制OVA致敏和激发所致的气道嗜酸性粒细胞浸润，降低气道高反应性以及Th2型细胞因子的表达。白介素-10（IL-10）是炎症抑制因子，由Th2细胞、树突状细胞、巨噬细胞、调节性T细胞等分泌。DC等细胞分泌的IL-10，诱发调节性T细胞-1（Tr1）进一步分泌IL-10，大量的IL-10可抑制Th2细胞，从而抑制哮喘和过敏性疾病，IL-10对哮喘和过敏性疾病的作用机制仍不明确，IL-10各种研究资料结果差异很大，哮喘患者BALF和血中的IL-10上升和下降的表达都有报道。IL-10对IL-1、IL-4、IL-12、TNFα、NF-κB等多种炎症因子具有抑制作用，从而间接抑制哮喘患者的肺组织EOS炎症和气道高反应性等，合成IL-10代表机体的保护性调节。哮喘患者的肺组织EOS炎症，是呼吸道变应性炎症的一个重要特征。血管细胞粘附分子-1（VCAM-1），作为特异性地介导嗜酸粒细胞浸润到肺组织的粘附分子，在哮喘中可能扮演了重要的角色。VCAM-1除了引起EOS的粘附作用，可能还具有共刺激分子作用，参加机体的免疫调节。VCAM-1是粘附分子的一员，是一类调节细胞与细胞之间相互粘附、相互作用的膜表面糖蛋白，主要表达在活化内皮细胞、上皮细胞、巨噬细胞、树突状细胞上。VCAM-1的基因表达主要由转录因子NF-κB控制。各种致炎因子，如IL-1、IL-4、IL-12、TNFα和IFN-γ等诱导VCAM-1的表达。由于IL-10对IL-4、TNFα、NF-κB等多种炎症因子具有抑制作用，IL-10可能通过广泛地抑制炎症因子，间接对VCAM-1等粘附分子起一定的作用。本次课题设计，通过观察IL-10和VCAM-1的表达，探讨卡介苗对哮喘治疗的作用机制，为哮喘的实验理论研究提供支持。研究目的本研究给予初生幼鼠早期多次小剂量BCG接种，观察预防哮喘的长期（25周）效果。在此过程中，通过观察IL-10、VCAM-1在小鼠支气管肺泡灌洗液、肺组织中的表达，探讨BCG预防哮喘的机制。研究方法C57BL/6小鼠分为NS/NS（对照组）、NS/OVA组（模型组）和BCG105/OVA组、BCG105-3/OVA组。小鼠出生0、7、14天子减毒活疫苗BCG皮内注射接种，第5周、第7周2次卵白蛋白（OVA）腹腔注射致敏，25周3次雾化激发建立哮喘模型。最后一次抗原激发48h后收集支气管肺泡灌洗液（BALF），肺组织石蜡包埋和冰冻保存。肺组织HE染色，观察哮喘模型是否成功。RT-PCR方法测定肺组织VCAM-1和IL-10的mRNA水平，ELISA方法测定BALF的IL-10水平，肺组织石蜡切片免疫组化方法观察VCAM-1的表达情况。研究结果1．气道炎症变化肺组织病理切片HE染色显示，抗原激发48h后模型组肺组织EOS和炎症细胞浸润与对照组相比明显增多（n=6，P＜0.05），BCG105/OVA和BCG105-3/OVA肺组织EOS和炎症细胞浸润与模型组相比减少（n=6，P＜0.05）。2．RT-PCR检测肺组织IL-10 mRNA和VCAM-1 mRNA的水平模型组、BCG105/OVA组、BCG105-3/OVA组的IL-10 mRNA表达与对照组相比均明显增加，差异有显著性（n=6，p＜0.05）。而VCAM-1 mRNA各组与对照组间比较并无明显差异（n=6，p＞0.05）。3．ELISA检测BALF中IL-10蛋白表达的水平BCG105/OVA组IL-10水平与模型组、OVA+BCG105-3组相比有显著升高（n=6，p＜0.05），模型组、BCG105-3/OVA组与对照组相比有下降，但无显著性差异（n=6，p＞0.05）。4．免疫组化检测肺组织中VCAM-1蛋白表达的水平肺组织病理切片免疫组化染色显示，VCAM-1主要表达于支气管粘膜气道上皮、支气管平滑肌、血管内皮、血管周围淋巴等细胞胞浆中。气道上皮细胞哮喘模型组、BCG105/OVA组、BCG105-3/OVA组均呈不同程度的阳性（深棕黄色到浅棕黄色不等）表达，而对照组中呈弱阳性（浅棕黄色）表达。用秩和检验，四组样本总体有显著差异性，P＜0.05。样本两两比较显示，BCG105/OVA组与对照组、模型组、BCG105-3/OVA组比较有显著性差异（n=6，p＜0.05）。结论1．小鼠生命早期接种BCG，预防哮喘有长期（25周）作用，同时与BCG接种的剂量大小有关。2．IL-10对哮喘起保护性调节作用，可能与APC的免疫调节、Treg的激活、Th2细胞的抑制等有关。3．BCG治疗后VCAM-1表达的升高，可能对哮喘小鼠免疫调节起一定的作用。VCAM-1在哮喘的发生中可能有复杂的作用，一方面参与了哮喘小鼠肺组织嗜酸性粒细胞炎症浸润的病理过程，另一方面可能作为协同刺激信号激活CD4+T细胞，起免疫监督作用。