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酿酒酵母是食品级安全性真菌，广泛应用于食品工业和生物医药领域。酿酒酵母细胞具有完善的蛋白质加工体系，确保蛋白质的折叠、翻译后修饰，目前已有多种药物蛋白由酿酒酵母生产。然而，酿酒酵母对异源蛋白的分泌水平普遍较低，严重制约了其的工业化应用。提高酿酒酵母分泌水平的方法主要是优化发酵和从基因层面调节异源蛋白分泌。目前酿酒酵母异源蛋白基因层面上的分泌策略主要以小分子蛋白质为研究对象，对30KDa以上的蛋白质种类研究较少。本文以漆酶(53KDa)为例，尝试寻找一系列适合较大分子的分泌表达策略。 本文通过在酿酒酵母中优化漆酶的启动子、信号肽和共表达与异源蛋白合成和分泌相关的蛋白质（简称“辅助蛋白”），使漆酶的胞外分泌水平提高，还发现辅助蛋白组合可提高α-淀粉酶和增强型绿色荧光蛋白EGFP的分泌水平，具有一定的普遍适用性。具体研究如下: 1、选择启动子TEF1和GAL1，构建并发酵产胞内酶菌株，以了解漆酶在酿酒酵母胞内的表达情况;在此基础上引入α-因子信号肽，构建产胞外酶菌株，发酵并测定胞内外酶活，纯化蛋白后跑SDS-PAGE，考察各菌株的漆酶表达水平。结果表明:所选漆酶基因能在酿酒酵母胞内表达和胞外分泌。在T=72h，启动子GAL1对应菌株的漆酶胞外酶活高于启动子TEF1对应菌株，分别为129.73±2.57U/L和30.52±2.56U/L。因此，选GAL1为胞外产酶菌的启动子用于后续实验。 2、选取酿酒酵母天然α-因子信号肽、菊粉酶天然信号肽、合成信号肽以及漆酶天然信号肽，比较其介导的漆酶分泌效果。合成信号肽介导的漆酶胞外酶活和分泌率较α-因子信号肽分别提高了1.39倍和99％，另外两种信号肽对应菌株未检测到胞外酶活。综合考虑胞外酶活和分泌率，确定合成信号肽用于后续实验。 3、选取八个辅助蛋白，将其过表达，考察对漆酶分泌的作用。结果表明RPP0、SSO2、BIP、PDI四个辅助蛋白使漆酶胞外酶活和分泌率提高，其胞外酶活依次下降。其中RPP0过表达的菌株B/pGSLC-yPRP的胞外酶活为444.24±2.82U/L，分泌率为25.73±0.73％，分别较空白对照B/pGSLC-YEplac181提高了69％和46％。 4、考察分泌效果较好的PDI、BIP、SSO2和RPP0四个辅助蛋白间的协同作用。结果表明RPP0和SSO2，RPP0和BIP，RPP0和SecI三组蛋白存在促进蛋白胞内表达和胞外分泌的协同作用。其中，RPP0和SSO2的协同作用对漆酶分泌最显著，其胞外酶活为585.21±1.28U/L，分泌率为30.36±0.71％，较过表达RPP0的菌株B/pGSLC-yPRP分别提高了31％和18％，较空白对照B/pGSLC-YEplac181分别提高了1.23倍和73.19％。 5、考察辅助蛋白RPP0和SSO2共表达对提高其他异源蛋白分泌水平的普遍适用性。结果表明RPP0和SSO2共表达使得菌株的α-淀粉酶的胞外酶活较空白对照提高了73％，EGFP发酵液上清的荧光强度较空白对照提高8％，RPP0和SSO2共表达对于大分子蛋白质α-淀粉酶表现出更明显的促进分泌效果。 最终，通过优化启动子、信号肽和过表达辅助蛋白，漆酶的胞外酶活从30.52±2.56U/L提高到585.21±1.28U/L，提高了18.17倍。 本课题的研究意义在于:运用基因层面上的调控策略，不仅提高了大分子蛋白质-漆酶在酿酒酵母中的分泌量，而且首次发现了辅助蛋白RPP0和SSO2在提高异源蛋白分泌水平上具有较强的协同作用和普遍适用性，对提高其他异源蛋白在酿酒酵母的分泌水平具有一定的指导意义。