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产氢细菌的产氢能力不高是限制生物制氢技术发展的重要因素。运用分子生物学的手段对菌种进行改造,是提高生物产氢效率的重要方法。乙醇和乳酸是产酸克雷伯氏菌Klebsiella oxytoca HP1厌氧发酵产H2的主要副产物,切断无益副产物能提高H2产量和底物转化率。本研究以K. oxytoca HP1作为受体,构建了同源双臂整合载体pTA-Str和pLDH-Tr。利用内源平台双交换原理,将质粒pMHE6上携带的氨基葡萄糖苷腺苷转移酶基因(Aminoglycoside-3’-adenyltransferase,aadA)外源表达盒序列(含T7启动子,aadA编码框,T4终止子)定点插入到受体菌细胞染色体乙醇脱氢酶系(含乙醛脱氢酶和乙醇脱氢酶活性)基因adhE +868～+869区(adhE起始编码框为+1)位点上。并在此基础上以质粒pTA-Str介导K. oxytoca HP1 adhE的插入失活,获得了具有链霉素抗性的adhE-突变株。运用类似方法将pBR322上携带的四环素抗性蛋白基因(tetracycline resistance protein,tet)外源表达盒序列(含P1、P2启动子,tet编码框)定点插入到受体菌细胞染色体乳酸脱氢酶基因LDHa +518～+519区( LDHa起始编码框为+1)位点上。在此基础上以质粒pLDH-Tr介导K. oxytoca HP1 LDHa的插入失活,获得了具有四环素抗性的LDHa-突变株。葡萄糖发酵实验结果表明,相同发酵条件下, adhE-突变菌比野生菌的产氢量提高了16.07%,乙醇产量下降了70.47%;LDHa-突变株比野生菌的产氢量提高了20.35%。本研究构建的Klebsiella oxytoca HP1突变株adhE-和LDHa-,将为进一步研究高效产氢系统奠定基础。