一、文献综述本章主要阐述慢性肾病的定义、分期及危害,总结了导致慢性肾病进程加速的肠道菌群紊乱与慢性肾病进展之间的关系;总结了肠源性尿毒素及其前体的来源、体内合成与代谢过程、在慢性肾病进展中的重要作用以及研究进展,整理了靶向肠道菌群或肠源尿毒素治疗慢性肾病的研究进展;归纳了黄葵及其主要黄酮类化合物的药理作用及研究现状,为设计黄葵及其黄酮类化合物基于肠道菌群的治疗慢性肾病机制研究方案,建立化合物对肠道细菌的作用评价体系,发现化合物干预尿毒素合成特点提供理论基础。二、黄葵干预慢性肾病模型大鼠体内尿毒素生成及对其代谢通路的调控作用肠道菌群的紊乱与慢性肾病进展密切相关。本课题组前期研究发现黄葵给药后其主要活性成分黄酮苷类生物利用度低,在肠道内停留时间长,提示黄葵可能作用于肠道菌群发挥药效。本章主要基于慢性肾病动物模型,研究黄葵对模型动物体内肠道细菌介导的尿毒素生成及其代谢通路的影响。发现黄葵有效降低肠道细菌的代谢产物——肠源性尿毒素硫酸吲哚酚在血浆、肝脏及肾脏中的含量。在尿毒素IS体内的代谢通路中,黄葵不影响IS在宿主肝脏中的代谢通路,即不影响吲哚向IS的转化过程;黄葵主要作用于IS在肠道菌群内的代谢通路,即可以抑制肠道细菌内吲哚合成,此外,黄葵并不抑制吲哚合成相关细菌——肠杆菌科的丰度,而是直接抑制肠道细菌合成吲哚的能力。为了观察黄葵对慢性肾病下肠道细菌的代谢产物肠源性尿毒素的调控作用,使用UPLC-TQ/MS检测正常大鼠、模型大鼠及黄葵给药后大鼠的血浆、肝脏和肾脏内的硫酸吲哚酚以及硫酸对甲酚的含量。结果发现:模型大鼠血浆内硫酸吲哚酚及硫酸对甲酚含量显著高于正常大鼠,在黄葵灌胃4周以后,模型大鼠血浆、肝脏及肾脏中硫酸吲哚酚含量显著降低,但对血浆内硫酸对甲酚含量无显著影响。硫酸吲哚酚的合成包括两步:第一步,肠道细菌通过色氨酸酶,将食物中的色氨酸代谢为硫酸吲哚酚前体吲哚;第二步,吲哚通过门静脉进入肝脏,进一步被宿主肝脏细胞中细胞色素P450酶羟基化后,在磺基转移酶的作用下生成硫酸吲哚酚。为了确认黄葵对于尿毒素硫酸吲哚酚体内合成的作用环节,针对其合成途径做出了相应的研究实验。首先,采用向动物直接灌胃吲哚,以吲哚为底物促进IS生成,以黄葵给药或预给药的方式,检测最终动物体内IS的蓄积情况。利用UPLC-TQ/MS检测大鼠血浆、肝脏及肾脏中硫酸吲哚酚含量,观察黄葵提取物对吲哚在宿主体内向硫酸吲哚酚转化过程的影响,结果发现:黄葵提取物灌胃并不能降低吲哚灌胃导致的大鼠血浆及肾脏中硫酸吲噪酚的升高,提示黄葵不影响硫酸吲哚酚在宿主体内的代谢过程。随后,为了考察黄葵对硫酸吲哚酚在肠道菌群内代谢过程的影响,使用HPLC-FLD检测模型组及黄葵组大鼠粪便内硫酸对甲酚前体吲哚的含量,结果发现:黄葵能够显著降低慢性肾病导致的肠道内高吲哚水平。以上结果说明,黄葵主要通过降低肠道内硫酸吲哚酚前体吲哚的含量,干扰肠道细菌内硫酸吲哚酚代谢途径,最终减少体循环内尿毒素的含量。为了明确黄葵是如何干扰肠道内吲哚合成,采用16S rDNA测序评价黄葵对吲哚合成相关菌丰度的影响。建立了 5/6肾切除大鼠慢性肾病模型,黄葵连续灌胃八周,收集各组大鼠新鲜粪便进行16S rDNA测序,比较不同组别大鼠菌群差异。结果发现:CKD导致大鼠肠道菌群紊乱,多类细菌丰度发生改变,其中,变形菌门-肠杆菌科细菌丰度显著扩增,而肠杆菌科细菌富含色氨酸酶,可将色氨酸转化为吲哚,这与前期实验结果即CKD模型大鼠肠道内吲哚含量增高呈正相关。但是,测序结果发现,黄葵不影响模型大鼠肠道内肠杆菌科细菌丰度。该结果提示黄葵降低肠道内吲哚含量并不通过抑制肠道内吲哚合成相关酶的丰度。为了明确黄葵对肠道细菌合成吲哚能力是否存在干扰,选取了大肠杆菌作为模式细菌,依托厌氧工作站、HPLC-FLD及多功能酶标仪等仪器,建立了体外测定黄葵抑制肠道细菌合成吲哚的厌氧培养体系。体外实验发现:黄葵可剂量依赖性抑制大肠杆菌合成吲哚,抑制能力具有时间依赖性,即随共孵时间延长而降低,其中400 μg/ml的黄葵提取物对大肠杆菌生长的影响低。以上结果在粪便混合细菌实验中得到了验证。三、黄葵干预肠道细菌合成吲哚的作用机制研究前述研究发现,黄葵提取物可通过调控肠道细菌中吲哚的合成,有效降低模型大鼠体内肠源性尿毒素硫酸吲哚酚的含量,本章在该基础上,基于厌氧培养体系,以大肠杆菌为模式菌,研究黄葵中黄酮类化合物抑制细菌合成吲哚的作用机制。发现黄葵活性成分黄酮苷类异槲皮苷能够剂量依赖性的非致死性抑制多种来源的肠道细菌合成吲哚,并且能够抑制小鼠肠道内吲哚合成,该效应不是通过抑制吲哚的唯一代谢酶色氨酸酶来实现的,而是抑制了细菌的外源性色氨酸摄取。黄酮苷类化合物主要通过抑制电子传递链上复合体I的活性,抑制NADH向NAD的转化,从而减少质子生成,干扰细菌膜外质子势能的建立,削弱膜外质子梯度,从而使被协同转运入细菌的色氨酸含量降低,最终导致吲哚合成量的减少。为了选取黄葵中抑制细菌合成吲哚的有效成分进行进一步机制研究,选取黄葵中主要的黄酮类化合物异槲皮苷、杨梅素、槲皮素、金丝桃苷进行活性筛选,结果发现:四种黄酮类化合物均可不同程度的抑制大肠杆菌合成吲哚,其能力由高到低为:异槲皮苷、杨梅素、槲皮素、金丝桃苷,对细菌生长情况影响由低到高为:异槲皮苷、金丝桃苷、槲皮素、杨梅素。各化合物抑制细菌吲哚分泌能力均表现出时间依赖性,即随共孵时间延长,其吲哚抑制能力逐渐降低。值得注意的是,黄酮苷类化合物异槲皮苷能够非致死性的有效抑制细菌合成吲哚。为了进一步验证异槲皮苷抑制细菌合成吲哚的活性,将不同浓度的异槲皮苷与大肠杆菌进行共孵,检测其对细菌生长及吲哚分泌的影响,结果发现:异槲皮苷能够降低大肠杆菌细胞内和培养液上清中吲哚含量,且其能力呈浓度依赖性以及时间依赖性。为了确认异槲皮苷是否为非特异性抑制大肠杆菌合成吲哚,收集正常的C57BL/6小鼠和SD大鼠的盲肠内容物以及粪便,将4种肠道混合细菌分别与异槲皮苷共同孵育。结果发现:异槲皮苷对多种来源的肠道混合细菌的吲哚合成均有显著的抑制作用,并且对细菌的生长均无影响。此外,为了研究异槲皮苷对肠道内吲哚合成的影响,采用抗生素鸡尾酒法将大肠杆菌植入正常或模型小鼠体内,发现异槲皮苷组小鼠粪便吲哚含量较对照组显著降低。以上实验说明异槲皮苷能够有效抑制体内体外的肠道细菌合成吲哚。吲哚在细菌内的合成需要经过两个关键环节,分别是外源性色氨酸向细菌内部转运、细菌内色氨酸代谢酶将色氨酸代谢为吲哚。为了研究黄酮苷类化合物对吲哚合成关键环节的影响,分别考察了黄酮苷类化合物对细菌色氨酸酶活力和色氨酸转运过程的影响。首先考察黄酮苷类化合物是否影响细菌内色氨酸代谢酶的活性,采取酶促反应测定黄酮苷对色氨酸代谢酶活力的影响,结果发现:与对照组相比,黄酮苷不显著影响色氨酸代谢酶的活力。该结果说明,黄酮苷不直接干预色氨酸向吲哚的转化过程。为研究黄酮苷类化合物是否干预了色氨酸向细菌内部的转运,利用UPLC检测细菌培养液上清中色氨酸的剩余含量。结果发现:在黄酮苷存在时,细菌培养液上清中色氨酸浓度显著高于对照组,即黄酮苷组摄取至细菌内部进行反应的色氨酸转运量显著低于对照组。利用UPLC-TQ/MS检测细菌内部及培养液上清中同位素标记色氨酸含量的实验结果验证了以上发现。以上结果说明,黄酮苷并不直接抑制色氨酸酶活力,而是通过直接抑制外源色氨酸向细菌内部的转运来降低细菌的吲哚产量。色氨酸向细菌内部转运需要膜外质子动力(质子梯度)的协同转运作用,而这种质子梯度又是由膜上电子传递链产生。为了研究黄酮苷对细菌膜外质子梯度的影响,采用荧光显微镜和膜电位探针碳菁染料DiOC2(3)分析细胞膜电位,结果发现:在细菌与黄酮苷共孵后,细菌呈现较弱的红色荧光强度,表明膜电位降低,即膜外质子势能降低。该结果说明黄酮苷能够扰乱细菌膜电位,降低细菌膜间隙的质子势能。采用电子传递链复合体I活力检测评价黄酮苷对电子传递链的影响,结果发现:在大肠杆菌与黄酮苷共孵后,细菌电子传递链复合体I的活性较对照组显著下降。复合体I的活性可以通过NADH/NAD 比值体现,实验结果发现:黄酮苷存在时,细菌的NADH/NAD 比值显著增高,说明NADH向NAD的转化过程被抑制,导致该过程中质子的释放减少、膜外质子梯度削弱。质子梯度通过ATP合酶驱动ATP生成,为细菌生命活动提供能量,实验结果发现:黄酮苷的存在显著降低细菌内ATP含量。以上实验结果提示,黄酮苷通过干扰细菌膜外质子势能的建立来降低色氨酸向细菌内部的转运。为了进一步验证以上观点,采用向细菌培养体系中加入过量的电子传递链的终端电子受体,加速电子传递链进程、加快质子势能的建立的方法,观察黄酮苷类的质子动力耗散效应导致的色氨酸转运量降低的表现是否被逆转。结果发现:氧气、DMSO及TMAO等终端电子受体的存在显著减弱了黄酮苷对色氨酸转运的抑制作用,降低了细菌吲哚合成的抑制率。四、小分子化合物抑制肠道细菌合成吲哚的构效关系研究本章主要围绕黄酮苷及黄酮苷元化合物抑制细菌合成吲哚的能力进行构效关系分析,此外进行了其它类别小分子化合物构效关系分析的拓展性实验。研究发现了黄酮葡萄糖苷类化合物抑制细菌分泌吲哚的起效机制,主要分为三个方面,包括消耗细菌膜外氢质子的苷水解过程、其能够降低电子传递链复合体工活性的黄酮苷元如槲皮素的释放,以及通过代谢物阻遏效应抑制色氨酸酶表达的葡萄糖的释放,其中黄酮苷的水解是必不可少的一环。研究发现黄酮苷元分子结构的平面性以及其酚羟基的多少是决定其活性的关键。此外还发现了其他二苯乙烯类化合物和二酮类化合物能够有效抑制细菌分泌吲哚,但与黄酮苷不同的是此类化合物有显著的杀菌作用。为了研究黄酮苷类化合物的构效关系,利用HPLC-FLD、UPLC等检测细菌培养液中吲哚浓度以及细菌培养液中黄酮苷原型及水解后苷元的浓度。结果发现:在与大肠杆菌共孵过程中,菌液中黄酮葡萄糖苷浓度随共孵时间延长而逐渐降低,同时其苷元浓度随培养时间延长而逐渐增加;抑制吲哚合成能力更强的葡萄糖苷类黄酮苷,在与细菌共孵后会被逐渐水解,而一直以原型形式存在的其他糖苷类抑制吲哚合成的能力极低。随后实验发现:将黄酮葡萄糖苷的水解产物葡萄糖联合苷元槲皮素作用细菌后,其抑制吲哚分泌的效果显著低于单独使用黄酮苷。以上实验结果提示黄酮苷类化合物抑制细菌合成吲哚的三条途径:包括消耗细菌膜外氢质子的苷水解过程、其能够抑制电子传递链活性的黄酮苷元如槲皮素的释放、通过代谢物阻遏效应抑制色氨酸酶表达的葡萄糖的释放。为了研究黄酮苷元类化合物的构效关系,利用HPLC-FLD检测了基于以槲皮素为中心的黄酮苷元与细菌共孵后培养液中吲哚浓度。综合实验结果可以推测黄酮苷元类化合物构效关系:当黄酮苷元类酚羟基数量一致时,对细菌分泌吲哚的抑制率为黄酮醇类>黄酮类>二氢黄酮醇类>黄烷-3-醇类,平面性分子活性相比非平面型分子更强;当黄酮苷元主要结构一致时,其A、B环酚羟基越多,抑制细菌合成吲哚的能力越强。并得到以下基础结构是黄酮苷元抑制细菌合成吲哚的关键基团:C-环上羰基结合2,3-双键、B-环中邻二酚羟基以及C-环中3位羟基,这些关键官能团均是黄酮苷元发挥抑制细菌合成吲哚活性的重要组成部分。最后,为了探讨的其他类别的中药小分子化合物抑制细菌中吲哚合成的构效关系,利用HPLC-FLD检测了五类化合物与细菌共孵后培养液中吲哚浓度。结果发现:二苯乙烯类化合物的抑制细菌吲哚合成的能力最强,其次为二酮类化合物姜黄素,但与黄酮苷类化合物非致死性的抑制能力不同,这两类化合物均对细菌的生长有显著抑制作用。其余类别的小分子化合物如蒽醌类、苯丙素类及三萜类,未表现出明显的抑制细菌合成吲哚的能力。