随着科学技术、外科水平的突飞猛进,心脏移植已成为心脏终末期心脏病的有效治疗手段,但是仍然面临着器官需求和可获取器官数量严重不成正比、器官利用率低、器官保存时间较短以及心脏移植后免疫排斥反应以及长期免疫抑制治疗所导致的感染、恶性肿瘤等并发症等诸多问题。因此如何延长器官的保存时间、增加器官的利用率、改善心脏储存过程中的炎症反应等具有重要的临床意义,可缓解部分供需不平衡、降低术后相关并发症的发生。钙蛋白酶(Calpain)是一类依赖钙离子激活的蛋白酶,Calpain-1和Calpain-2为两种经典、普遍存在的钙蛋白酶,通过限制性酶解细胞内多种酶及细胞骨架蛋白系统,调节其它蛋白质的生物学活性,从而在细胞周期、收缩、细胞凋亡、细胞迁移、细胞分化和细胞信号转导等过程中起重要作用[1]。细胞骨架蛋白非红系α-光谱蛋白Spectrin作为内源性钙蛋白酶底物,在病理生理条件下、细胞发生坏死过程中,细胞钙蛋白酶剪切Spectrin产生150kDa和145kDa的分解产物(SBDPs)[2],可以作为Calpain活化的标志。Calpastatin是一种内源性抑制蛋白,特异性作用于Calpain-1和Calpain-2,Calpastatin 可与 Calpain-1 和 Calpain-2 发生特异性结合,从而抑制 Calpain-1和Calpain-2酶解活性[3]。研究发现Calpain/Calpastatin平衡在急性免疫排斥反应中发挥重要作用,通过Calpastatin过表达来抑制Calpain可延迟同种异体免疫排斥反应[4]。本研究旨在分析Calpain/Calpastatin在离体心脏中的表达变化规律,并通过在体过表达Calpastatin来抑制Calpain激活,为离体心脏保护机制研究提供方法。目的1、研究Calpain/Calpastatin在离体心脏中表达变化规律。2、建立Calpastatin的高表达方法。研究方法1、建立离体心脏灌注模型,获取小鼠心脏后用微量灌注泵经升主动脉灌注HTK液2h,然后置于4℃ HTK心脏保存液中,分别放置0h、1h、2h、3h、4h,模拟离体心脏冷缺血2h、3h、4h、5h、6h的状态,然后通过Western Blot测量心肌组织中Calpain-1、Calpain-2、Spectrin 及 Calpastatin 的蛋白表达量的变化。2、扩增含有Calpastatin基因的重组腺病毒,经小鼠左心室腔内注射含有Calpastatin基因腺病毒载体(Ad-Calpastatin),48h后提取心肌组织,通过Western Blot检测Calpastatin的表达。研究结果1、离体心肌组织中的calpain-1 3h、4h、5h、6h蛋白表达量均较2h升高,且第5h达最高;calpain-2 3h、4h、5h、6h蛋白表达量均较2h升高,且在第5、6小时达最高;离体心肌组织中的Spectrin 3h、4h、5h、6h蛋白表达量均较2h组织升高,且第6h达最高值;Calpastatin 4h、6h蛋白表达较2h升高,3h、5h无明显差异。Calpain/Calpastatin平衡打破,呈现高应激状态。2、经小鼠左心室腔内注射含有Calpastatin基因腺病毒载体48h后,心肌组织中的Calpastatin蛋白表达量明显提高。结论(1)HTK液保存下离体小鼠心脏,Calpain-1和Calpain-2表达量增加,酶活性增高。(2)通过小鼠左心室腔内注射含有Calpastatin基因腺病毒载体,可提高心肌组织中Calpastatin蛋白表达量,有望发挥对离体心脏的保护作用。