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第一部分急性心肌梗死患者血清外泌体miRNA筛选及生物信息学分析[目 的]急性心肌梗死（Acute myocardial infarction,AMI）是导致患者心源性死亡的首要原因,寻找AMI新的诊断标志物和治疗靶点一直以来都是临床医生关注的重点。既往研究发现,多种外泌体miRNA在AMI后表达升高,且可能与心梗后心室重塑相关,提示外泌体miRNA有潜力成为AMI诊断和预后评估的生物标志物。由于miRNA数量繁多,参与的调控网络比较复杂,因此,本部分研究旨在通过生物信息学方法筛选AMI患者血清外泌体miRNA及关键基因,为后续临床试验及机制研究提供依据。[方 法]1.查阅GEO数据库以及相关文献、论文,筛选AMI患者外泌体miRNA表达变化的相关数据,提取差异性表达的miRNA;2.结合miRNA数据库,对筛选出miRNA的靶基因进行预测,并进行GO和KEGG富集分析;3.选择表达上调的miRNA,结合文献,进一步缩小miRNA范围,对最终筛选出的miRNA进行靶基因预测,STRING软件对靶基因进行蛋白互作网络分析,结合分析结果筛选出关键基因;4.对最终筛选出的关键基因进行GO和KEGG富集分析,并采用Cytoscape软件建立miRNA与关键靶基因相互作用的网络图。[结 果]1.共纳入7个研究,提取出77个有表达差异的miRNA,其中32个miRNA表达上调,45个miRNA表达下调;2.通过数据库预测到77个miRNA共有12335个靶基因,共富集到2588条GO条目,主要富集在生长发育及信号传导等生物学过程,富集到150条KEGG通路,主要为内吞、MAPK、PI3K-Akt、Ras等信号通路;3.结合文献阅读,最终筛选出12个miRNA,依次为:miR-17-3p、miR-21-3p、miR-29a-3p、miR-30a-5p、miR-122-5p、miR-125a-5p、miR-126-3p、miR-146a-5p、miR-146b-5p、miR-150-5p、miR-199a-5p、miR-214-3p;4.共筛选出90个关键基因,富集到了 1571条GO条目,主要富集在细胞外基质和结构重构、正向调控细胞黏附等生物学过程,富集到154条KEGG通路,主要为黏着斑激酶、PI3K-Akt、MAPK、Toll样受体、TNF等信号通路。[结 论]生物信息学筛选出AMI患者外泌体内12个差异性表达的miRNA及90个关键基因,主要富集在细胞外基质重构等生物学过程,参与了 PI3K-Akt、MAPK、Toll样受体、TNF等信号通路。第二部分血清外泌体miR-146a-5p对急性冠脉综合征诊断和预后评估的价值研究[目 的]急性冠脉综合征（Acute coronary syndrome,ACS）是因冠状动脉不稳定斑块破裂,血栓部分或完全堵塞血管,从而引起急性缺血的一种临床综合征,而AMI是其最重要的临床分型。ACS早期诊断、及时治疗对降低其死亡率,改善远期预后至关重要。结合第一部分生物信息学筛选结果,我们在预实验中发现,AMI患者血浆miR-146a-5p表达水平显著高于冠脉正常组,在急诊介入手术治疗后血浆miR-146a-5p表达水平下降,72小时后逐渐上升,提示miR-146a-5p可能参与AMI发生发展。因此,本部分内容旨在探索血清外泌体miR-146a-5p（exo-miR-146a-5p）对ACS诊断和预后评估的价值。[方 法]1.收集入组患者血液样本及一般临床资料;2.提取患者血清中的外泌体（Exosomes）,采用透射电镜、纳米颗粒跟踪分析、蛋白质印迹法（Western Blot,WB）进行鉴定;3.采用实时荧光定 量 PCR（real-time quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-qPCR）观察血清 exo-miR-146a-5p 的表达水平;4.采用酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）观察入选患者血清白介素1β（interleukin-1β,IL-1β）、白介素 6（interleukin-6,IL-6）、肿瘤坏死因子 α（tumor necrosis factor-α,TNF-α）的表达水平;5.通过受试者工作曲线（receiver operating characteristic,ROC）分析血清exo-miR-146a-5p 对 ACS 的诊断价值;6.对ACS患者进行随访,记录一年内主要心血管不良事件（Major adverse cardiovascular events,MACE）的发生率,随访指标包括:心源性死亡、心力衰竭、再发心肌梗死、再次血运重建,并采用ROC曲线分析血清exo-miR-146a-5p对ACS预后评估的价值。[结 果]1.ACS组白细胞、肌钙蛋白I、N末端B型利钠肽原表达水平明显高于对照组（P＜0.01）,左室射血分数低于对照组（P＜0.01）,其余临床指标未见显著差异（P＞0.05）;2.透射电镜提示:镜下可见外泌体呈圆形或类圆形囊泡结构;纳米颗粒跟踪分析提示:提取样本中囊泡的平均直径为83.18 nm;WB提示:外泌体表达特征性蛋白（CD9、CD63、CD81 和 HSP70）;3.ACS患者血清exo-miR-146a-5p表达水平明显高于对照组（P＜0.01）;4.ACS患者血清炎症因子（IL-6、IL-1β、TNF-α）表达水平明显高于对照组患者;5.血清exo-miR-146a-5p可用于诊断ACS,具有较高的敏感性（71.4%）和特异性（92%）;6.ACS患者一年MACE发生率为17.5%;7.血清exo-miR-146a-5p对ACS患者MACE发生有较高的预测价值,敏感性和特异性分别为81.8%和75%。[结 论]血清exo-miR-146a-5p可作为ACS诊断和预后评估新的生物标志物。第三部分血清外泌体miR-146a-5p对H9C2心肌细胞缺氧复氧后炎症反应和细胞凋亡的影响[目 的]研究表明,外泌体miRNA参与了炎症反应、细胞迁移、增殖、凋亡等过程,在ACS、心肌缺血再灌注损伤中发挥着重要作用。本部分研究旨在探索血清exo-miR-146a-5p对H9C2心肌细胞缺氧复氧（H/R）后炎症反应和细胞凋亡的影响。[方 法]1.H9C2细胞经H/R处理后,分别采用RT-qPCR检测细胞miR-146a-5p的表达水平,CCK-8试剂盒检测H9C2细胞活力,ELISA检测培养基中炎症因子（IL-6、IL-1β、TNF-α）的表达水平,流式细胞术（Flow cytometry,FCM）和 TUNEL免疫荧光检测H9C2细胞凋亡水平;2.提取健康志愿者血清中的外泌体,采用miR-146a-5p模拟物（mimics）、抑制物（inhibitor）或阴性对照组（NC）对exo-miR-146a-5p表达水平进行改造,而后采用RT-qPCR检测exo-miR-146a-5p表达水平;3.荧光显微镜下观察血清外泌体被H9C2细胞摄取情况;4.将健康志愿者血清外泌体或改造后的外泌体与H9C2细胞进行共培养,经H/R诱导心肌细胞损伤,而后采用CCK-8试剂盒检测H9C2细胞活力;采用ELISA检测培养基中炎症因子（IL-6、IL-1β、TNF-α）表达水平;采用FCM、TUNEL免疫荧光检测H9C2细胞凋亡水平。[结 果]1.与正常培养细胞相比,H9C2细胞经H/R处理后miR-146a-5p表达水平明显下降、细胞活力减弱、炎症因子表达升高、细胞凋亡率显著增加（P＜0.01）;2.miR-146a-5p mimic或inhibitor转染至血清外泌体后,miR-146a-5p表达水平明显升高或降低（P＜0.01）;3.血清外泌体可被H9C2细胞摄取;4.与H/R组相比,外泌体组和miR-146a-5p mimics外泌体改造组对H9C2细胞H/R后损伤均具有保护作用,可增强细胞活力、减轻炎症反应、减少细胞凋亡（P＜0.01）,且miR-146a-5pmimics外泌体改造组效果更显著（P＜0.01）。[结 论]血清exo-miR-146a-5p对H9C2细胞H/R损伤具有保护作用,其机制可能与减轻炎症反应和减少细胞凋亡有关。第四部分miR-146a-5p通过靶向IRAK1改善H9C2细胞H/R损伤的机制研究[目 的]第三部分研究发现血清exo-miR-146a-5p对H9C2细胞H/R损伤具有保护作用,但具体机制不清楚。生物信息学结果提示:IRAK1是exo-miR-146a-5p的关键靶基因,并可富集到NF-κB信号通路。因此,本部分研究将结合IRAK1和NF-κB信号通路,探索血清exo-miR-146a-5p改善H9C2细胞H/R损伤的分子机制。[方 法]1.使用数据库预测miR-146a-5p的靶基因,结合文献阅读及生物信息学结果,挑选关键靶基因进行后续研究;2.采用双荧光素酶基因报告实验验证miR-146a-5p与IRAK1的靶向关系;3.IRAK1过表达慢病毒转染H9C2细胞株,采用RT-qPCR及WB进行验证;4.将IRAK1过表达慢病毒（ov-IRAK1）或空载慢病毒（NC）与miR-146a-5p mimic 或 inhibitor共转染到H9C2细胞,经H/R处理后,RT-qPCR和WB分别检测TLR-4/IRAK1/TRAF6/NF-κB信号轴信使RNA（mRNA）和蛋白表达水平,WB检测细胞凋亡通路中的经典分子（Cleaved Caspase-3、Bcl-2、Bax）的蛋白表达水平。[结 果]1.miR-146a-5p对IRAK1具有直接靶向作用;2.IRAK1过表达慢病毒（ov-IRAK1）可稳定转染至H9C2细胞,转染后,IRAK1 mRNA和蛋白水平均明显增高（P＜0.01）;3.各组TLR-4/IRAK1/TRAF6/NF-κB信号轴mRNA和蛋白表达情况:①各组TLR-4 mRNA和蛋白质表达水平未见明显差异（P＞0.05）;②与NC组相比,miR-146a-5p mimics组IRAK1 mRNA和蛋白表达水平明显下降（P＜0.01）,抑制NF-κB信号通路活化;miR-146a-5p inhibitor组则具有相反的生物学效应:③miR-146a-5p mimics 和 IRAK1 过表达慢病毒载体（mimics+ov-IRAK1 组）同时转染后,可逆转miR-146a-5p mimics对H9C2细胞H/R的保护效应;4.各组细胞凋亡通路中的经典分子（Cleaved Caspase-3、Bcl-2、Bax）蛋白表达情况:①与 NC 组相比,miR-146a-5p mimics 组 Cleaved Caspase-3、Bax 蛋白表达水平明显下降,Bcl-2蛋白表达水平明显升高（P＜0.01）;miR-146a-5p inhibitor组Cleaved Caspase-3蛋白表达水平明显升高,Bcl-2蛋白表达水平明显下降（P＜0.01）;②与mimics组相比,ov-IRAK1+mimics组Bcl-2蛋白表达水平明显下降（P＜0.01）。[结 论]1.miR-146a-5p可通过靶向IRAK1基因,进而抑制NF-κB通路活化,减轻细胞炎症反应,从而改善H9C2细胞H/R后细胞损伤;2.miR-146a-5p可通过间接调控作用降低H9C2细胞H/R后细胞凋亡水平。