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脱落酸(abscisic acid，ABA)作为一种植物激素，已证实不仅在调控植物休眠、衰老和果实发育等诸多过程中起着重要的调节作用，而且，在植物对干旱、低温、盐碱等逆境胁迫的反应中起着共同凋节因子的作用。在ABA到达作用位点后，ABA应答反应的第一步是一系列的细胞信号感知和识别，其中，ABA受体对原初信号的识别起着关键的作用。利用ABA类似物能够激活不同的应答途径，推测在植物不同的组织结构中存在多种的ABA受体。尽管，通过遗传学、生物化学、细胞生物学方法，ABA结合蛋白的研究取得了巨大的进展。但是，遗憾的是至今仍然还未鉴定出任何可能的ABA受体。因此，真正意义上的ABA受体确定仍待做大量的工作。 近年来，我室利用亲和层析从蚕豆下表皮中分离出一种高亲合、高度特异性的ABA结合蛋白，并完成了对其生化特性深入分析及部分测序，且在一定程度上揭示了该蛋白与ABA的生理功能效应存在着内在的联系，这为进一步克隆ABA结合蛋白基因奠定了坚实的工作基础。本研究是在此基础上以基于测序的部分氨基酸序列设计的简并寡核苷酸为扩增引物，结合RT-PCR和RACE技术从蚕豆幼叶中克隆得到了两个全长cDNA序列，并建立了该基因甲醇酵母高效表达体系，通过ProBond resin镍亲和层析一次可纯化出毫克级表达蛋白，为ABA结合蛋白生理功能的进一步鉴定迈出了坚实的一步。 3′-／5′-RACE扩增片段序列分析结果表明，ABP370扩增片段的全长cDNA为3449核苷酸，其中5′非翻译区为876个核苷酸，3′非翻译区为369个核苷酸并末端带Poly(A)尾巴，从起始密码子ATG至终止密码子TGA，含有一个编码768个氨基酸残基的开放阅读框架(2304bp)；ABP640扩增片段的全长cDNA为1012核苷酸，其中5′非翻译区为88个核苷酸，3′非翻译区为144个核苷酸并末端带Poly(A)尾巴，从起始密码子ATG至终止密码子TAA，含有一个编码260个氨基酸残基的开放阅读框架(780bp)。 利用PCR技术将上述两个全长cDNA的编码区克隆到表达载体pMETα上，使之位于α因子信号肽序列的下游，6个组氨酸残基序列的上游，且与之同框，分别构建成融合蛋白分泌表达载体pMETαB／ABP2304和pMETαA／ABP780。通过LiCI化学转化法将构建的重组质粒插入到甲醇酵母PMAD16菌株的染色体上。筛选Ade+表型转化子，20ml BMMY摇瓶培养，用0.5％甲醇诱导表达5天后，SDS-PAGE检测结果表明：选出的重组高效表达菌株PMAD16／pMETαB／ABP2304和PMAD16／pMETαA／ABP780都存在明显的表达特异条带，分子量分别为75kD和55kD，分别占其总蛋白的30％和10％，经过ProBond Resin镍亲和层析柱都得到了纯化，其纯度都在90％以上，一次纯化分别可得到大约15mg和7mg表达蛋白，推知表达量分别高达0.75g／L和0.35g／L以上。~3H-ABA微量放射配基结合法实验结果表明，75kD纯化蛋白显示出较高的特异结合活性，55kD纯化蛋白无显著的特异结合活性。