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淋病奈瑟菌(Neisseria gonorrhoeae),俗称淋球菌,是性传播疾病淋病(Gonorrhea)的病原菌,只感染人类,可导致男性急性尿道炎、女性尿道炎、子宫颈炎、新生儿淋菌性急性结膜炎等。人对淋病奈瑟菌普遍易感,感染后不能产生强烈免疫应答,可反复感染。成簇规律间隔短回文重复序列(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat, CRISPR)是近年发现的细菌获得性免疫系统,由不连续的重复序列(Repeat)与间区序列(Spacer)间隔交替排列而成的CRISPR簇、前导序列以及一系列CRISPR相关蛋白基因(cas)构成。CRISPR系统可抵抗噬菌体或质粒等外源核酸对细菌的再次侵染。我们在CRISPR数据库中检索发现,目前已有3株淋病奈瑟菌中公布了CRISPR系统,课题组在WHO-A株淋病奈瑟菌中也发现有CRISPR系统的存在。目前Pubmed及中文数据库中均未能检索到关于淋病奈瑟菌CRISPR系统的报道,本文对淋病奈瑟菌CRISPR系统的结构和功能进行了生物信息学分析,并克隆了部分CRISPR簇。一、淋病奈瑟菌CRISPR系统的生物信息学分析检索CRISPR数据库(http://CRISPR.u-psud.fr/CRISPR/)发现,淋病奈瑟菌FA1090株、NCCP11945株和TCDC-NG08107株等的基因组中均有CRISPR簇的存在,共含12个CRISPR簇(计有15条间区序列)和7个疑似CRISPR簇(计有10条间区序列),这些CRISPI濮中约1/3具有相同的重复序列,但其含有的间区序列很少同源。通过BLAST分析间区序列,可知只有少数间区序列与噬菌体同源,而更多的是与淋病奈瑟菌自身基因同源,因此我们推测CRISPR系统对细菌水平基因转移的调控具有双向性。我们在分析CRISPR簇过程中发现了与其他细菌cas基因具有高度同源性的淋病奈瑟菌DNA序列,提示淋病奈瑟菌中也可能存在cas基因,推测其对外源基因的获得具有积极调控作用。二、淋病奈瑟菌WHO-A株基因组中CRISPR的筛查为分析淋病奈瑟菌其他菌株中是否也存在CRISPR系统,将本实验室保存的淋病奈瑟菌WHO-A株进行全基因组测序和序列分析。结果表明,WHO-A株基因组大小约为2.2 Mb,与淋病奈瑟菌MSll株基因组较为相似。在WHO-A株基因组中发现2个疑似cas基因、1个CRISPR簇和6个疑似CRISPR簇。重复序列之间具有高度相似性,与已公布的其他淋病奈瑟菌株CRISPR系统重复序列也高度同源。BLAST分析其间区序列,发现也只有少数间区序列与噬菌体同源,更多的是与自身基因同源,但其噬菌体同源基因明显多于其他3株淋病奈瑟菌,提示WHO-A株中水平基因转移多于3个已公布的菌株。染色体图谱分析发现,其他淋病奈瑟菌菌株中只有MSl 1株在对应于WHO-A株cas基因的位置上也存在着同源cas基因,其余菌株如FA1090等的对应位置主要为假定蛋白基因,这些基因是否编码特殊的cas蛋白还有待于进一步研究。三、淋病奈瑟菌WHO-A株CRISPR扩增及CRISPR-靶基因间相互作用研究的预试验对已公布的淋病奈瑟菌CRISPR序列进行分析,据此设计4对CRISPR引物,用本实验室保存的5株淋病奈瑟菌为模板进行PCR扩增,核酸电泳结果显示,在淋病奈瑟菌WHO-A株中扩增到4个不同分子量的DNA片段,提示WHO-A株中可能存在多种CRISPR片段。但扩增产物克隆后测序表明只有一对引物FA1扩增出了有效片段,序列分析表明该DNA片段中存在3个重复区和2个间区,具备CRISPR系统的结构特征；间区序列除了靶向菌毛相关基因外,更多靶向假定蛋白基因。为顺利研究CRISPR系统和靶基因间相互作用机制,构建了可作为靶基因携带载体的pET30a-EGFP重组质粒,并筛选了可与此重组质粒具有相容性的CRISPR系统携带载体。