前言目前,胃癌仍是一个重要的公共卫生问题,世界范围内,胃癌的发病位于所有恶性肿瘤的第四位,是癌症死亡原因的第二位。全世界每年有1,000,000的新发病例。我国是胃癌的高发国家,占所有恶性肿瘤的第二位。手术治疗是治愈胃癌的唯一手段,但是大多数患者在诊断时已经处于疾病晚期,化疗仍是晚期胃癌的主要治疗方法。胃癌目前尚无标准的化疗方案,现有化疗方案的疗效亦难尽如人意。分子靶向治疗是近年来在血液和实体肿瘤的治疗中涌现出来的新治疗手段。随着胃癌发生、发展和转移过程中分子生物学机制的研究进展,也逐步将分子靶向治疗应用于胃癌治疗的临床实践。EGFR是目前分子靶向治疗的研究热点,以EGFR为靶点的分子靶向治疗已经广泛应用与临床。EGFR是ErbB家族的成员之一,是一种170KD的膜受体蛋白,具有酪氨酸激酶活性,结合生长因子能够活化细胞内信号转导,促进细胞的增殖,而受体本身则发生内化及下调。近年来的研究显示,Cbl蛋白在下调EGFR的过程中发挥重要作用。c-Cbl及Cbl-b是CBL(The Casitas B-cell lymphoma)家族两个重要成员,具有连接体功能及E3泛素连接酶功能,能靶向一系列蛋白质使之降解,包括以EGFR为代表的一系列具有酪氨酸激酶活性的受体蛋白,在维持机体稳态中发挥重要作用。c-Cbl和Cbl-b结构上包含若干功能区:1个N端酪氨酸激酶结合区(TKB)、环指(RF)区、TKB和RF之间保守的衔接区(Linker结构域)、以及具有泛素连接酶活性的C末端。目前,国内外对于胃癌中c-Cbl、Cbl-b和EGFR的表达及其相关性的研究较少,现有的研究显示,EGFR是胃癌的独立预后指标,而尚未发现c-Cbl与胃癌预后存在相关性,尚未见Cbl-b在胃癌中的相关研究。本研究制作胃癌组织芯片,应用免疫组化的方法,检测三种蛋白在胃癌中的表达情况,分析其与胃癌临床病理特征的关系,以及三者之间的相互联系,旨在探讨c-Cbl、Cbl-b和EGFR在胃癌组织中的表达及其临床意义。材料和方法1、病例和标本共有124例来自于中国医科大学附属第一医院及辽宁省肿瘤医院2005年10月～2006年8月手术切除的胃癌(术前未行放化疗)组织标本。其中男性92例,女性32例。年龄24～85岁,中位年龄60岁。病理均为腺癌,高分化(乳头状腺癌,高分化管状腺癌)11例,中分化(中分化管状腺癌)29例,低分化(低分化腺癌,印戒细胞癌,粘液腺癌)84例。胃癌组织分期采用国际抗癌联盟(UICC)1997年修订的P-TNM分期标准,癌组织浸润深度划分如下:t1粘膜层或粘膜下层,t2肌层或浆膜下,t3穿透浆膜,t4侵犯临近结构;其中t1为3例,t2为73,t3为40例,t4为8例;未发生淋巴结转移24例,发生淋巴结转移100例;发生远处转移者5例,未发生者119例;Ⅰ期17例,Ⅱ期46例,Ⅲ期37例,Ⅳ期24例。124例胃癌组织取其中24例距胃癌组织5厘米以远的正常胃组织作为对照。2、试剂鼠抗人c-Cbl单克隆抗体购自BD公司;鼠抗人Cbl-b单克隆抗体购自SANTACRUZ公司;鼠抗人EGFR单克隆抗体、S-P检测试剂盒及DAB显色液均购自福州迈新生物技术开发有限公司。3、方法将124例胃癌标本与24例正常胃组织标本制作成组织芯片,采用免疫组化S-P法,按照S-P检测试剂盒说明书所示步骤进行。4、免疫组化结果判定c-Cbl、Cbl-b和EGFR均以胞膜和/或胞浆出现棕黄色颗粒为阳性染色,于显微镜400倍视野下随机选取5个有代表性的不同区域,每个视野的得分由阳性细胞的比例和显色强度两方面决定,依照阳性细胞比例:＜5%、5%-25%、25%-50%、50%-75%、＞75%分别得0分、1分、2分、3分、4分;依照显色强度:未着色、浅黄色、棕黄色、棕褐色分别得0分、1分、2分、3分;将两项得分相乘得到该视野的最终得分,选取的5个视野得分的平均值为最后得分。最后该切片按照得分分为以下四个等级:0-1分为(-),2-4分为(+),5-7分(++),≥8分为(+++)。(-)为阴性,(+)为弱阳性表达,(++)～(+++)为强阳性表达。5、统计学分析以SPSS13.0软件进行统计分析。计数资料组间比较应用四格表x~2检验。c-Cbl、Cbl-b和EGFR表达情况为有序等级资料,组间比较采用Mann-Whitney U非参数检验;相关性分析采用Spearman等级相关分析。显著水平α=0.05。实验结果1、c-Cbl、Cbl-b和EGFR在胃癌组织中的表达c-Cbl、Cbl-b和EGFR在胃癌组织中的阳性表达率分别为71.0%、82.3%和56.5%,均为高水平表达。2、胃癌组织中c-Cbl、Cbl-b和EGFR的表达情况与临床病理因素的关系c-Cbl蛋白表达与浸润深度及病理分期有关(P＜0.05),且随浸润程度加深及病理分期变晚而表达增强(相关系数及P值分别为r=0.219,P=0.015和r=0.266,P=0.003),而与性别、年龄、分化程度及淋巴结转移无关(P＞0.05);Cbl-b蛋白表达与淋巴结转移及病理分期有关(P＜0.05),且随着有淋巴结转移及病理分期变晚而表达增强(相关系数及P值分别为r=0.190,P=0.034和r=0.298,P=0.001),与性别、年龄、分化程度及浸润深度无关(P＞0.05);EGFR蛋白表达与浸润深度及病理分期有关(P＜0.05),且随浸润程度加深及病理分期变晚而表达增强(相关系数及P值分别为r=0.286,P=0.001和r=0.362,P=0.000),而与性别、年龄、分化程度及淋巴结转移无关(P＞0.05)。3、胃癌组织中c-Cbl、Cbl-b和EGFR表达之间的相关性c-Cbl蛋白、Cbl-b蛋白与EGFR蛋白的表达强度均呈正相关,相关系数及P值分别为r=0.241,P=0.007;r=0.183,P=0.042。4、胃癌组织中c-Cbl、Cbl-b与EGFR蛋白三者均强阳性表达与临床病理特征之间的关系124例胃癌组织病理标本中共有27例三种蛋白同时呈强阳性表达,在分化程度差,肿瘤组织浸润程度深,淋巴结转移数目多及分期晚的病例中更多见。结论1、c-Cbl、Cbl-b与EGFR在胃癌中高水平表达;c-Cbl蛋白的表达强度与胃癌的浸润深度及病理分期呈正相关;Cbl-b蛋白的表达强度与胃癌的淋巴结转移及病理分期呈正相关;EGFR蛋白的表达强度与胃癌的浸润深度及病理分期呈正相关。三者同时强阳性表达更多见于分化程度差,浸润程度深,淋巴结转移数目多及分期晚的病例中。间接提示三种蛋白的阳性表达可能作为肿瘤预后的判断指标,尤其是三者同时呈强阳性表达。c-Cbl、Cbl-b和EGFR表达强度均呈正相关,可能提示三者在促进胃癌的发生发展中存在某种依存性或相关性。2、c-Cbl/Cbl-b联合EGFR系统,可能与胃癌的发生,浸润及转移相关,c-Cbl、Cbl-b有可能成为新的胃癌的分子标志物。