本文以我国北方重要的水产养殖经济动物刺参(Apostichopus japonicus Selenka)为研究对象,研究主要的多糖类免疫增强剂(β-葡聚糖、肽聚糖和壳聚糖)对刺参生长、免疫及抗病力的影响。并运用微生物学方法,通过体外实验从刺参肠道、养殖水环境及养殖池底泥中筛选出对刺参有益的潜在益生菌,通过在体养殖实验,研究了筛选出的5株潜在益生菌(TMRC14、TC116、T13、TC22和EN25)对刺参稚参苗(初始平均体重0.2-0.4 g)生长、免疫及抗病力的影响,结果表明菌株T13、TC22和EN25对刺参稚参苗是有益的。因此选取T13、TC22和EN25三株细菌,通过养殖实验,研究在饲料中添加这3株益生菌对刺参幼参(初始平均体重3-5 g)生长、免疫及抗病力的影响,并探讨它们分别与低聚果糖复配的效果。同时对这3株细菌进行了鉴定,并对其最适的培养条件进行了初步摸索。主要研究内容和结果如下:1.以初始体重为(4.926±0.009) g的刺参为研究对象,探讨了在饲料中添加0 g/kg、1.25 g/kg、2.50 g/kg的β-葡聚糖对刺参生长、免疫及抗病力的影响。实验在循环水系统中进行,每个处理设3个重复。经过8周的养殖实验后,对刺参进行灿烂弧菌(Vibrio splendidus)攻毒。结果表明当饲料中添加1.25 g/kg的β-葡聚糖时,刺参的特定生长率显著高于对照组和2.50 g/kg添加组(P<0.05);后两者之间无显著差异(P>0.05)。饲料中添加β-葡聚糖能显著提高刺参体腔细胞的吞噬活性(P<0.05),而对其呼吸爆发活力的影响并不显著(P>0.05)。随着饲料中β-葡聚糖含量的升高,刺参体腔细胞内酚氧化酶活性显著升高(P<0.05)。刺参体腔细胞内酸性磷酸酶的活性随饲料β-葡聚糖含量升高而有升高的趋势,但各处理组间差异不显著(P>0.05)。攻毒实验表明,1.25 g/kg的β-葡聚糖可以显著降低灿烂弧菌对刺参的致病死亡率(P<0.05)。由此可见,饲料中添加适量的β-葡聚糖(1.25 g/kg)可以提高刺参的特定生长率、非特异性免疫力及抗病能力。2.以初始体重为(4.931±0.005) g的刺参为研究对象,在循环水系统中进行8周的养殖实验,探讨在基础饲料中分别添加0 mg/kg、200 mg/kg和500 mg/kg的肽聚糖对刺参生长、免疫及抗病力的影响。实验结果表明,随着饲料中肽聚糖含量的升高,刺参的特定生长率呈上升趋势,但各处理之间无显著差异(P>0.05)。饲料中添加肽聚糖显著提高了刺参体腔细胞的吞噬活性(P<0.05),而对其呼吸爆发活力的影响不显著(P>0.05)。饲料中添加200 mg/kg的肽聚糖可以显著提高刺参体腔细胞的酚氧化酶活性(P<0.05),而500 mg/kg添加组与对照组无显著差异(P>0.05)。随着饲料中肽聚糖添加量的升高,刺参体腔细胞内酸性磷酸酶活性呈下降趋势,其中,500 mg/kg肽聚糖添加组显著低于对照组和200 mg/kg的添加组(P<0.05)。攻毒实验表明,饲料中添加肽聚糖可以提高刺参对灿烂弧菌的抵抗能力,其中添加200 mg/kg的肽聚糖显著降低了刺参的致病死亡率(P<0.05)。由此可见,虽然饲料中添加肽聚糖对刺参的生长没有显著影响,但适量的肽聚糖(200 mg/kg)可以显著提高刺参的免疫力和抗病力。3.以初始体重为(3.734±0.016) g的刺参为研究对象,在循环水系统中进行8周的养殖实验,在基础饲料中分别添加0 g/kg、2.5 g/kg、5 g/kg和10 g/kg的壳聚糖,探讨其对刺参生长、免疫及抗病力的影响。实验结果表明,饲料中添加不同梯度的壳聚糖对刺参的生长无显著影响(P>0.05)。当壳聚糖的添加量为10 g/kg时,刺参体腔细胞密度和吞噬活性得到显著提高(P<0.05),但其它添加量组与对照组之间没有显著差异(P>0.05)。饲料中添加壳聚糖对刺参体腔细胞呼吸爆发活力有提高的作用,但影响不显著(P>0.05)。饲料中添加壳聚糖对刺参体腔细胞酚氧化酶活性没有显著影响(P>0.05),但显著降低了刺参体腔细胞内酸性磷酸酶的活力(P<0.05)。攻毒实验表明,饲料中添加壳聚糖并不能显著提高刺参对灿烂弧菌的抵抗能力(P>0.05)。因此,壳聚糖作为免疫增强剂在刺参上的应用需要进一步探讨。4.用2216E、TSB和MRS培养基,从健康刺参肠道、患病刺参肠道和体壁、刺参养殖池底泥和池水中分离得到细菌182株,以刺参“腐皮综合征”致病菌—灿烂弧菌和假交替单胞菌为指示菌,筛选出对灿烂弧菌或者假交替单胞菌有抑制作用的菌株19株,并对其菌落形态和革兰氏染色情况进行了观察。通过菌株16S rDNA的序列比对,确定19株细菌全部属于芽孢杆菌属。为了进一步筛选刺参潜在的益生菌,对19株细菌的产蛋白酶和淀粉酶性能进行了研究。根据细菌的分离来源及菌落形态和对病原菌的抑制作用情况,选取5株潜在的益生菌用于刺参的安全性实验。结果表明5株潜在的益生菌TMRC14、TC116、T13、TC22和EN25对刺参是安全的,可以成为刺参益生菌的候选菌株,用于后续的实验。5.以初始体重为(0.204±0.009) g的刺参为研究对象,探讨在基础饲料(鼠尾藻粉)中分别添加10~5、10~7、10~9 CFU/g的TMRC14或者TC116对刺参生长、免疫力及抗病力的影响。养殖实验一共进行30d,静水养殖,每天换水50%。养殖实验结束后,对刺参进行7d灿烂弧菌浸浴攻毒。结果表明,饲料中添加TMRC14对刺参的特定生长率(SGR)没有显著影响(P>0.05);添加10~5-10~7 CFU/g的TC116时,刺参的SGR和对照没有显著区别(P>0.05),但当添加量升高到10~9 CFU/g时,刺参的SGR显著下降(P<0.05)。饲料中添加TMRC14或者TC116对刺参体腔细胞密度没有显著影响(P>0.05)。当TMRC14的添加量为10~9CFU/g时,刺参体腔细胞的吞噬活性显著升高(P<0.05),刺参体腔细胞的呼吸爆发活性也在10~9CFU/g时达到最高,但与对照和其它添加组没有显著差异(P>0.05)。饲料中添加10~7CFU/g TC116时,体腔细胞吞噬活性显著高于对照和其它添加量组(P<0.05)。刺参体腔细胞呼吸爆发活性在TC116的添加量为10~7CFU/g时显著高于对照和其它添加量组(P<0.05),而10~5CFU/g和10~9CFU/g添加组与对照没有显著差异(P>0.05)。攻毒实验表明,饲料中添加10~7CFU/g和10~9CFU/g的TMRC14时,降低了刺参浸浴灿烂弧菌的死亡率,但与对照无显著差异(P>0.05)。饲料中添加10~5CFU/g和10~7CFU/g的TC116时,降低了刺参浸浴灿烂弧菌的死亡率,但与对照并无显著差异(P>0.05)。因此,TMRC14和TC116在刺参生长、免疫和抗病力促进方面的作用并不显著,在刺参稚参苗的生产养殖过程中应用价值不大。6.以初始体重为(0.204±0.009) g的刺参为研究对象,探讨在基础饲料(鼠尾藻粉)中分别添加10~5 CFU/g、10~7 CFU/g、10~9 CFU/g潜在的益生菌T13或TC22对刺参生长、免疫及抗病力的影响。以初始体重为(0.375±0.024) g的刺参为研究对象,探讨在基础饲料中添加10~5 CFU/g、10~7 CFU/g、10~9 CFU/g潜在的益生菌EN25对刺参生长、免疫及抗病力的影响。养殖实验共进行30d,静水养殖,每天换水50%。养殖实验结束后,对刺参进行7d的灿烂弧菌浸浴攻毒实验。结果表明,当饲料中分别添加10~9 CFU/g的T13或者TC22时,刺参的特定生长率显著升高(P<0.05),而添加EN25对刺参的生长没有显著影响(P>0.05)。饲料中添加T13、TC22、EN25对刺参体腔细胞数量没有显著影响(P>0.05)。饲料中添加10~9 CFU/g的T13或者TC22可以显著提高刺参体腔细胞吞噬活性、呼吸爆发活力和总一氧化氮合酶活力(T-NOS)(P<0.05),但对刺参体腔细胞内超氧化物歧化酶(SOD)、酸性磷酸酶(ACP)活力无显著影响(P>0.05)。当饲料中EN25的添加量为10~7 CFU/g时,刺参的体腔细胞吞噬活性、呼吸爆发活力和T-NOS显著高于对照组(P<0.05),而10~5-10~7 CFU/g的EN25对刺参体腔细胞内SOD、ACP无显著影响(P>0.05);添加量为10~9 CFU/g时,刺参体腔细胞内SOD显著降低(P<0.05),但对ACP无显著影响(P>0.05)。攻毒实验表明,饲料中分别添加10~9 CFU/g的T13或者TC22可以显著降低灿烂弧菌攻毒后刺参的死亡率(P<0.05)。饲料中添加10~7 CFU/g的EN25时,刺参抵御灿烂弧菌感染的能力显著高于对照组(P<0.05)。因此T13、TC22、EN25可以作为益生菌应用到刺参的育苗过程中。7.以初始体重(4.893±0.028) g的刺参为研究对象,在循环水系统中进行8周的养殖实验,在饲料中分别添加0、10~7、10~9 CFU/g的T13,并在每个T13添加水平,分别添加0、0.5%的果糖,以3×2的实验设计配制6种饲料,探讨饲料中添加T13和果糖及两者复配对刺参生长、免疫、肠道菌群及抗病力的影响。养殖实验结束后,每个重复取6头刺参用于免疫指标及肠道菌群分析,剩余刺参用于灿烂弧菌攻毒实验。结果表明,随着饲料中T13含量的升高,刺参SGR有升高的趋势,饲料中单独添加果糖或者与T13复配也提高了刺参的SGR,但所有处理组与对照差异不显著(P>0.05)。饲料中添加T13使刺参体腔细胞吞噬活性、呼吸爆发活性、酚氧化酶活性及一氧化氮合酶活性都得到提高,其中酚氧化酶活性显著高于对照组(P<0.05)。饲料中添加T13显著提高了刺参肠道可培养细菌总数(P<0.05),当T13添加量为10~9 CFU/g时,刺参肠道中弧菌总数显著高于对照(P<0.05),但当添加量为10~7 CFU/g时,刺参肠道弧菌总数与对照没有差异(P>0.05)。饲料中添加10~9 CFU/g T13显著降低了灿烂弧菌攻毒后刺参的死亡率(P<0.05)。饲料中添加0.5%的果糖可以显著提高刺参体腔细胞吞噬活性、呼吸爆发和酚氧化酶活性,并显著降低刺参攻毒后的死亡率(P<0.05)。饲料中果糖与T13复配与否,对刺参肠道可培养细菌总数没有显著影响(P>0.05)。单独添加果糖显著降低了刺参肠道弧菌总数(P<0.05),但果糖与T13复配对刺参肠道弧菌总数影响不显著(P>0.05)。饲料中0.5%果糖与T13复配时,刺参体腔细胞吞噬活性、呼吸爆发、酚氧化酶活性有所升高但和对照没有显著差异(P>0.05),而刺参一氧化氮合酶在果糖与10~9 CFU/g T13复配组显著高于对照组(P<0.05)。果糖与T13复配使刺参抗病力得到显著提高(P<0.05),但与单独添加果糖或者10~9 CFU/g T13相比并没有显著差异(P>0.05)。8.以初始体重(4.918±0.022)g的刺参为研究对象,在循环水系统中进行8周的养殖实验,在饲料中分别添加0、10~7、10~9 CFU/g的TC22,并在每个TC22的添加梯度,分别添加0、0.5%果糖,以3×2的实验设计配制成6种饲料,探讨饲料中添加TC22和果糖及两者复配对刺参生长、免疫、肠道菌群及抗病力的影响。养殖实验结束后,每个重复取6头刺参用于免疫指标及肠道菌群分析,剩余刺参用于灿烂弧菌攻毒实验。结果表明,在不同的TC22添加梯度下,无论添加果糖与否,刺参的特定生长率都与对照无显著差异(P>0.05)。随着饲料中TC22含量的升高,刺参体腔细胞吞噬活性、呼吸爆发活性及酚氧化酶活性都得到显著提高(P<0.05),而刺参体腔细胞一氧化氮合酶活性呈现先升高后降低的趋势,但与对照组没有显著差异(P>0.05)。饲料中添加10~9 CFU/g TC22显著提高了刺参肠道可培养细菌总数(P<0.05),但刺参肠道中弧菌总数并没有受到饲料中添加TC22和果糖的影响(P>0.05)。饲料中添加10~9 CFU/g TC22显著降低了灿烂弧菌攻毒后刺参的死亡率(P<0.05),添加0.5%的果糖可以显著提高刺参的免疫反应,降低刺参的死亡率(P<0.05)。饲料中0.5%果糖与10~9 CFU/g TC22复配时,刺参的免疫力和抗病力得到显著提高(P<0.05)。因此,益生菌TC22对刺参的健康有促进作用,并且和果糖复配具有正向的交互作用。9.以初始体重(3.127±0.012) g的刺参为研究对象,在循环水系统中进行8周的养殖实验,在饲料中分别添加0、10~7、10~9 CFU/g的EN25,并在每个EN25添加水平,分别添加0、0.5%的果糖,以3×2的实验设计配制成6种饲料,探讨饲料中添加EN25和果糖及两者复配对刺参生长、免疫、肠道菌群及抗病力的影响。养殖实验结束后,每个重复取6头刺参用于免疫指标及肠道菌群分析,剩余刺参用于灿烂弧菌攻毒实验。结果表明,当饲料中添加10~7 CFU/g EN25时,刺参SGR最高,但与对照和其它组差异不显著(P>0.05);饲料中添加果糖或者果糖与EN25复配对刺参SGR无显著影响(P>0.05)。饲料中单独添加EN25时,刺参体腔细胞吞噬活性、呼吸爆发活性显著高于对照组(P<0.05),但其酚氧化酶和一氧化氮合酶活性并没受到显著影响(P>0.05)。与对照相比,饲料中单独添加EN25对刺参肠道可培养细菌总数无显著影响(P>0.05),却显著降低了肠道弧菌总数(P<0.05)。饲料中单独添加EN25显著降低了灿烂弧菌攻毒后刺参的死亡率(P<0.05)。饲料中单独添加0.5%的果糖可以提高刺参体腔细胞吞噬活性、呼吸爆发、酚氧化酶和一氧化氮合酶活性,并显著降低刺参的死亡率(P<0.05)。饲料中0.5%果糖与EN25复配时,刺参体腔细胞吞噬活性、呼吸爆发、酚氧化酶和一氧化氮合酶活性有所升高,其中吞噬活性得到显著提高(P<0.05),呼吸爆发在果糖与10~7 CFU/g EN25复配组显著高于对照组(P<0.05)。饲料中果糖与EN25复配与否,对刺参肠道可培养细菌总数没有显著影响(P>0.05);而当果糖与10~7 CFU/g EN25复配时,刺参肠道弧菌总数显著降低(P<0.05)。果糖与EN25复配提高了刺参抵抗灿烂弧菌的能力,并在EN25的复配浓度为10~9 CFU/g时达到显著水平(P<0.05)。10~.通过Biolog微生物自动鉴定系统和16S rDNA序列的聚类分析相结合的方法,对筛选出的对刺参育苗和幼体养成都有有益作用的3株益生菌(T13、TC22和EN25)进行了鉴定并对其最适的摇瓶培养条件进行了简单研究,结果表明T13和枯草芽孢杆菌聚为一类,最适培养条件为:接种量2%、装液量50ml/250ml、初始最佳pH 7.0、温度32℃、转速180 r/min。TC22和地衣芽孢杆菌聚为一类,最适培养条件为:接种量4%、装液量75ml/250ml、初始最佳pH 7.2、温度30℃、转速180 r/min。EN25和蜡样芽孢杆菌聚为一类,最适培养条件为:接种量1%、装液量25ml/250ml、初始最佳pH 8.0、温度30℃、转速为180 r/min。