乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)属于嗜肝DNA病毒科(Hepadnaviridae),是世界上分布最为广泛的病毒之一。据世界卫生组织统计,全球有3.5亿乙肝病毒携带者,其中约50%在我国,是一个非常严重的公共卫生问题。乙肝病毒的持续性感染会导致慢性肝炎(chronic hepatitis),并与肝硬化(liver cirrhosis)以及肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)等一系列肝脏疾病的发生发展密切相关。在乙肝病毒感染患者的血清中,除了直径为42nm的成熟病毒颗粒外,还能检测到大量直径在22nm,主要由病毒表面抗原(hepatitisB surface antigen,HBsAg)组成的亚病毒颗粒,HBsAg颗粒与病毒颗粒之比能高达1000:1。如此大量且持续性的病毒包膜蛋白表达是乙肝病毒独有的特征,至今尚未在其他病毒中发现类似的现象。持续表达的HBsAg是慢性乙肝诊断的一个重要指标,病人血清HBsAg阳性超过6个月即被认为罹患慢性肝炎,而且血清HBsAg的清除也是目前乙肝治疗的一个难点。因此,研究HBsAg亚病毒颗粒持续表达的机制及其对宿主细胞功能的影响,不仅有助于深入了解乙肝病毒的致病机理,而且也为设计和开发新的针对HBsAg的药物及制剂提供理论依据。为了研究HBsAg持续性表达对宿主细胞功能的影响,阐明HBsAg在病毒感染和致病机制中的作用,本课题的第一部分利用HepG2细胞构建了乙肝病毒表面抗原主蛋白(hepatitis B small surface antigen,SHBs)的稳定表达细胞株(HepG2-S-G2)以及稳定转染载体质粒并平行传代的对照细胞株(HepG2-Neo-F4)。应用基因芯片技术对这两株细胞基因表达谱的差异进行了比较。结果发现SHBs表达导致许多细胞基因的表达水平发生了变化。进一步的功能学分析发现,包括细胞的糖代谢和脂类代谢、细胞的生长和凋亡、细胞骨架和细胞外基质形成以及一些细胞内重要信号转导通路在内的许多细胞功能都受到了不同程度的影响。在这些基因中,淋巴增强结合因子(lymphoid enhancer-bindingfactor 1,LEF-1)基因的转录变化最为明显,而且在有完整HBV病毒颗粒产生的HepG2.2.15细胞中LEF-1基因转录水平也发生了同样趋势的变化。此外,结合对HepG2-S-G2细胞基因表达谱的分析结果,还研究了SHBs表达对细胞功能的影响。结果发现SHBs对细胞蛋白亲环素A(cyclophilin A,CyPA)的分泌具有促进作用。本课题的第二部分,研究了SHBs对LEF-1基因转录调控作用的分子机制。LEF-1是Wnt信号转导通路中一个关键的转录因子,对Wnt通路下游一系列效应分子的转录和表达起着调控作用,从而影响细胞增殖和细胞周期的调控。细胞转染以及siRNA干扰实验的结果均证实SHBs的表达能上调LEF-1基因的转录水平。细胞免疫荧光染色实验发现SHBs的表达影响了LEF-1蛋白在细胞内的分布。在HepG2-Neo-F4对照细胞中,LEF-1蛋白主要分布在细胞核中,而在HepG2-S-G2细胞中,LEF-1蛋白不仅在细胞核中,而且在细胞质中也有分布。进一步的研究发现,受到SHBs调控的是LEF-1基因的截短异构体,而并非其全长蛋白。该截短异构体据报道具有拮抗全长蛋白行使其正常功能的作用。这些结果提示,SHBs调控的LEF-1转录上调并不遵循经典的Wnt信号转导通路,SHBs对Wnt通路的影响并非激活性的,而是抑制性的。本课题的第三部分,研究了细胞蛋白CyPA与SHBs相互作用的分子机制及其临床意义。在转染SHBs的Huh7细胞中发现,SHBs的表达能促进CyPA分泌。该现象同样存在于HBsAg阳性的转基因小鼠和HBV感染病人体内,在转基因小鼠和病人血清中CyPA含量较对照均有明显的升高。为研究胞外CyPA在乙型肝炎发病机制中的作用,用尾静脉高压注射法将SHBs基因注入C57BL/6J小鼠体内并使其在肝脏细胞中表达。结果发现伴随CyPA分泌的增加,HBsAg阳性的肝细胞周围有明显的炎症细胞浸润现象。提示分泌的CyPA可能在乙肝病毒引起的应激反应以及炎症反应中起到了重要的免疫调节作用。此外,通过免疫共沉淀实验,发现SHBs与CyPA有直接而且特异性的蛋白-蛋白相互作用。此外,用CyPA抑制剂环孢霉素A(cyclosporine A,CsA)处理细胞后,SHBs的表达有明显的下降,提示胞内CyPA对于乙肝病毒表面抗原的合成和折叠过程可能是必需的。本课题从转录体组学角度系统研究了SHBs持续表达对肝细胞基因表达谱的影响,揭示了SHBs与LEF-1以及CyPA相互作用新的分子机制。本课题的研究结果不仅为阐明乙肝病毒表面抗原在肝炎发病机理中的作用提供了新的理论依据,也为开发针对HBsAg的药物提供了新的切入点。