第1章非出血活性的五步蛇毒锌金属蛋白酶FII与其内源性三肽抑制剂复合物的晶体结构研究 P-I类蛇毒金属蛋白酶可以直接水解纤维蛋白/纤维蛋白原，因而可作为潜在的溶栓药。但是这类酶同时还可水解血管基底膜蛋白，因此可能导致出血副反应。为了更好地了解来源于五步蛇蛇毒的锌金属蛋白酶FII的作用机制，为对其进行结构修饰以提高其药理作用的特异性并减少副反应提供结构方面的信息，我们采用汽相扩散悬滴法制备FII蛋白晶体，并对该晶体进行X-射线衍射分析，得到了FII蛋白的1.9 A分辨率的晶体结构，发现一个该酶分子由两个亚结构域组成，并含两个高度保守的特征性序列：锌结合序列H<,142>E<,143>XXH<,146>XXGXXH<,152>和Met—turn：C<,163>Ⅰ<,164>M<,165>。其中N-端结构域占了蛋白全长的大约3/4，是一个典型的a/β结构。4个a螺旋围绕着四个平行的和一个反平行的β片层。C-端结构域包含了一个长的a螺旋和Met-turn。蛋白水解活性必需的锌离子位于两个结构域之间的间隙中，并与高度保守序列H<,142>E<,143>XXH<,146>XXGXXH<,152在>中三个组氨酸残基的Nε2氮原子和一个水分子螯合。在电子密度图上还清晰地看到在活性中心周围有一个三肽，其序列为Lys—Asn—Leu(KNL)，通过一些实验证实这一三肽对FII的活性有抑制作用。 我们实验室在毕赤酵母中成功地表达了来源于Agkistrodon acutus的无出血活性的P-I类重组蛇毒金属蛋白酶rFII，并发现它对大鼠颈动脉血栓动物模型有良好的溶栓作用。但在高剂量时，rFII还可以降解血管基底膜蛋白，因此存在潜在的出血副反应。我们曾经尝试使用毕赤酵母表达的rFII进行结晶，希望通过晶体结构来解释其作用机理，并利用结构信息来对其进行改造，增加对作用底物的选择性，以减少临床应用的副反应。然而，始终未能得到晶体。推测其原因可能是酵母表达的异源蛋白存在不均一的翻译后修饰所致。大肠杆菌Escherichia coli(E.coli)是目前常用的另一个表达异源蛋白的宿主，具有不对所表达的蛋白进行翻译后修饰的优点，迄今为止大部分成功得到晶体结构的重组蛋白都是E.coli表达。因此我们重新将多个片断长度的rFII基因克隆到大肠杆菌表达载体pETl5b、pET32a及pMAL c2x和pMAL p2x上，在大肠杆菌菌株BL2l(codonplus)和／或Origami B中过表达。并采用亲和层析、离子交换层析和分子筛层析纯化“可溶性蛋白”，或采用尿素或盐酸胍从包涵体中变性并纯化重组蛋白，采用稀释、亲和柱辅助的手段使变性蛋白复性。未能得到可溶性有活性的rFII蛋白。 第3章 芳香烃受体核转位因子2(ARNT2)在大肠杆菌的克隆、表达和纯化bHLH/PAS蛋白超家族(basic Helix-Loop-Helix Per-Arnt-Sim proteins)是在许多重要生理和发育过程基因表达网络中关键的调节因子。ARNT2被认为是bHLH/PAS蛋白家族成员中的通用型配基，主要在中枢神经系统和肾脏表达，可与HIF-Iα结合形成二聚体，发挥调控缺氧应答的功能。ARNT2和SIM蛋白形成的二聚体可以调节下丘脑神经内分泌轴的发育进程。为了了解ARNT2在转录调节方面的分子机制，我们在E.coli克隆、表达和纯化了大鼠ARNT2(330-711)，但是未能得到晶体。 第4章 PDE9A(催化结构域)在大肠杆菌的表达、纯化及初步的晶体学研究环核苷酸磷酸二酯酶(phosphodiesterases，PDEs)可以通过降解环核苷酸(cAMP，caMP)而控制其在细胞内的浓度，从而影响多种生理过程。深入了解PDEs对环核苷酸底物特异性和抑制剂选择性的结构基础可以帮助设计效应更强、副作用更少的PDE抑制剂。我们从大肠杆菌菌株BL21(codonplus)表达并纯化了野生型和突变性PDE9A(催化结构域)，并得到了未结合配基的PDE9A、PDE9A和其水解产物GMP、PDE9A和非选择性抑制剂theophyline复合物以及两个PDE9A突变体和底物cGMP复合物的晶体。希望通过这些晶体的结构信息，更好地了解PDE9A对底物和抑制剂的识别和作用机制，以帮助设计选择性更高的抑制剂。