1研究背景Atherosclerosis(As)是一种危害人类健康的疾病,许多危险因素造成的血管内皮损伤及功能障碍是As发生的关键。血流剪切力(Fluid shear stress,FSS)是血流与管壁摩擦产生的平行于管壁的切线应力,FSS可保护血管内皮功能,减轻血管内皮炎症。异常FSS如过低将导致血管内皮功能紊乱,诱导血管内皮炎症,促进As的发生。异常FSS的发生与中医气虚血瘀密切相关。至今尚无让人十分满意的阻止As进展的西药。目前,statins,外科手术及介入手术在临床治疗As有确切疗效,但会伴有不同程度的副作用,研究指出statins能降低LDL-C的效果明显,但其降低LDL-C的效果不具有线性量效联系,剂量增加一倍,降低LDL-C水平的疗效也只能增加6%,而肝毒性和肌病等副作用增加。因此,寻求治疗As新方法很迫切。中医理论与临床实践证明,气虚血瘀是As的基本病因病机。益气补血类中药具有扩张外周血管,增加器官血流量,改善血液浓,粘,凝,聚的作用。当归补血汤具有补血,益气的功效。我们前期研究结果表明当归补血汤具有较好的内皮保护作用,其机制主要是抑制内皮炎症发生,促进内皮祖细胞的功能加强内皮修复。当归补血汤多靶点的内皮保护途经与生理性FSS抗As作用相似,因此在异常FSS环境中开展当归补血汤对血管内皮作用的研究,将为当归补血汤抗As研究供提供可靠的实验依据。2研究目的通过研究当归补血汤在异常FSS环境中保护As血管内皮损伤的药效,探讨当归补血汤对血液流变学,血脂,炎性因子的分泌和蛋白表达的影响,为当归补血汤治疗As提供了科学依据。3研究方法3.1异常FSS诱导As动物模型的复制和评估新西兰兔30只,适应性饲养1周后行右颈总动脉套管术,术后正常饲养2周。术前及术后2周末,全部动物行右侧颈总动脉彩超探测及血液流变学检测。计算FSS值,比较右侧颈总动脉术前及术后套管各节段剪切力FSS的大小,P<0.05为差异有显著性意义,异常FSS动物造模成功。30只异常血流剪切应力模型兔按体重随机分为2组:普饲组(15只)喂予普通饲料,高脂组(15只)喂予2%高胆固醇饲料。每日投食2次,在第8,16周末,超声探测两组动物右侧颈总动脉血流动力学,检测血液流变学,血脂及血管内皮功能(血清ET-1),观察动物双侧颈总动脉病理组织切片。以模型动物低血流剪切应力术区出现血管内皮As病变来评估异常FSS诱导As模型复制的周期。3.2当归补血汤对异常FSS动物模型动脉As病变的作用及机制研究按黄芪当归5:1,3:1,1:1配伍比例称取生药,两次煎,浓缩成含1g/mL生药的水煎液。新西兰兔120只,适应性饲养1周后,按体重随机分为8组,每组15只。全部动物麻醉后,假手术组不放套管,普通饲料喂养,余动物皆行右颈总动脉套管术,高脂喂养至第4周末,然后给药如下:A假手术组:灌胃等量生理盐水;B对照组:模型动物灌胃等量生理盐水;C中药组(共5组):模型动物灌胃当归补血汤;芪归比例5:1高剂量(6g/kg)组,5:1中剂量(3g/kg)组,5:1低剂量(1.5g/kg)组;芪归比例3:1(4g/kg)组和芪归比例1:1(2g/kg)组;D阿托伐他汀(atorvastatin,AVT)组:模型动物灌胃阿托伐他汀1.7 mg/kg;灌胃药物剂量按人与动物等效剂量折算,每天灌胃1次,给药12周,日投食2次,日粮为体重的1.5%,每周测体重1次以调整给药剂量,在第4周,16周末检测相关指标:血流动力学检测,颈总动脉病理组织学观察,血液流变学,血脂,血清ET-1及NO检测,免疫组织荧光染色观察颈总动脉VCAM-1,LOX-1及NF-κBp65蛋白的表达,兔外周血EPCs培养鉴定及功能检测。3.3统计学分析实验数据用SPSS22.0统计软件处理,数据用均数±标准差(X±s)表示,符合正态分布资料采用单因素方差分析(ANOVA)检验。组间比较若方差齐时用LSD法,方差不齐时用Tamhane’s T2法。若为非正态分布资料采用Mann-Whitney U秩和检验,P<0.05被认为有统计学意义。4研究结果4.1异常FSS诱导As动物模型的复制和评估4.1.1两组血流变学变化与普饲组相比,高脂组全血黏度明显升高,血浆黏度变大,红细胞变形指数降低,红细胞变形性差,血液黏度越大。4.1.2两组血清ET-1含量变化与普饲组相比高脂组兔血清ET-1明显升高。4.1.3两组血脂含量的变化与普饲组相比,高脂组血清TC,TG,LDL水平明显升高(P<0.05),HDL降低(P<0.05)。4.2当归补血汤对异常FSS动物模型动脉As病变的作用及机制研究4.2.1血流剪切应力的变化模型组与假手术组相比,舒张末期内径增大,收缩期峰值流速及舒张期血流速度明显降低(P<0.05)。用药组与模型组相比,舒张末期内径无明显变化,但无论是收缩期峰值流速还是舒张期血流速度都明显加快(P<0.05)。4.2.2总动脉低剪切力区域血管HE染色结果与假手术组相比,模型组套管近心端血管可看到明显的As斑块,斑块纤维帽形成,其下可见大量泡沫细胞及淋巴细胞浸润,纤维帽深部有大量胆固醇结晶及坏死物沉积,说明模型造模成功,与模型组相比,用药组仅3:1及1:1组有小部分As斑块形成,AVT见内膜的增厚,部分内膜不平滑,内皮细胞不完整有脱落现象,而5:1给药组无粥样斑块形成,且内膜完整。4.2.3血流变学结果与假手术组对比,模型组全血黏度明显升高,血浆黏度同样增大,红细胞变形指数降低。而与模型组比较,用药组全血黏度,血浆黏度都有不同程度的降低,其中芪归5:1高剂量组与AVT组降低效果最明显,芪归5:1中剂量组次之,红细胞变形指数只有芪归5:1中剂量组与AVT组有明显的升高(P<0.05)。4.2.4血脂含量的变化与假手术组比较,模型组TC,TG,LDL-C均明显升高,而HDL-C明显减少(P<0.05)。用药组与模型组相比较,TC,TG,LDL-C均有不同程度的降低,其中芪归5:1剂量组TC的含量最低,且高剂量组降低最明显,HDL-C水平芪归5:1中剂量组升高最明显。另外,LDL-C的含量,只有芪归5:1剂量组与模型组相比下降有统计学意义(P<0.05),而芪归3:1剂量组,1:1组与AVT组减少量与模型组相比无统计学意义。4.2.5血清ET-1含量与假手术组相比较,模型组ET-1含量明显上升(P<0.05)。用药组与模型组相比芪归比例5:1组与AVT组ET-1含量明显下降,其中高剂量组降低最明显(P<0.05)。而3:1与1:1组尽管血清ET-1含量降低,但其降低水平无统计学意义。4.2.6血清NO含量统计分析发现,各组血清NO结果相类似,无统计学意义。4.2.7血管组织ICAM-1检测模型组与假手术组相比,血管组织ICAM-1含量明显增加,两者差异有统计学意义(P<0.05)。而用药组与模型组相比较,血管组织ICAM-1含量均明显降低,差异有统计学意义(P<0.05)。4.2.8血管VCAM-1蛋白的表达结果模型组与假手术组比较,模型组血管组织VCAM-1荧光强度最大,VCAM-1在斑块内高表达;用药组与模型组相比,血管组织VCAM-1的荧光强度明显弱于模型组;在用药组中芪归比例5:1组与AVT组荧光强度较弱,其中5:1高剂量组荧光强度最弱,证明VCAM-1表达量最少,而1:1剂量组在用药组中荧光强度最强。4.2.9血管LOX-1蛋白的表达结果模型组与假手术组比较,血管组织LOX-1荧光强度最大,LOX-1在斑块内高表达;用药组与模型组相比,血管组织LOX-1的荧光强度明显弱于模型组;在用药组中芪归比例5:1组荧光强度显著降低,其中5:1高剂量组荧光强度最弱,证明LOX-1表达量最少,而1:1剂量组在用药组中荧光强度最强,AVT次之。4.2.10血管NF-κBp65蛋白的表达结果模型组与假手术组比较,模型组血管组织NF-κBp65蛋白荧光强度显著,NF-κBp65蛋白在斑块内高表达,用药组与模型组相比,血管组织NF-κBp65蛋白的荧光强度明显弱于模型组,在用药组中芪归比例5:1组与AVT组荧光强度较弱,其中AVT组荧光强度最弱,证明NF-κBp65蛋白表达量最少,而1:1剂量组在用药组中荧光强度最强。4.2.11荧光染色鉴定EPCs第16周末,抽取兔外周血,分离培养EPCs,5-7天后,我们采用FITC-UEA-I,DiI-acLDL和DAPI分别对分离的细胞进行染色,在荧光显微镜下观察,显示绿色荧光的为UEA-I阳性细胞,红色荧光的为DiI-acLDL阳性细胞,蓝色荧光则是细胞核,三染阳性细胞为正在分化的EPCs。4.2.12当归补血汤对兔外周血EPCs功能的影响模型组与正常组相比较EPCs集落数减少,迁移力及成小管力降低(P<0.05)用药组与模型组除1:1用药组外,其余各组EPCs集落增加,且EPCs迁移力及成小管力均有不同程度的增强,5:1高剂量组与AVT组药效作用最明显,而1:1用药组最差。5结论及讨论5.1异常FSS诱导As动物模型的复制和评估本研究采用单侧颈总动脉套管术建立异常FSS动物模型。发现喂特制高脂饲料8周,16周后,普饲组及高脂组右侧颈总动脉均形成了粥样硬化斑块,且在近心端及低剪切应力侧斑块最明显,并随时间延长而加重,而左侧颈总动脉未出现粥样硬化斑块。由于本实验进行了自身左侧对照,具有很强的可比性,除了切应力差异外,高脂组两侧颈总动脉的其他条件(包括动脉中的高脂血症)都完全相同,因此可以把右侧颈总动脉粥样硬化形成归因于异常剪切应力变化,且病理结果提示在近心端及低剪切应力侧斑块最明显,这与其他学者的研究报道是一致的,可得出以下结论:异常FSS可产生动脉粥样硬化病变,其中高脂合并低剪切力形成动脉粥样硬化斑块最明显。另外本研究还发现,喂高脂饲料后第16周兔的血脂四项指标即显著声高,血流剪切力与普饲组对比明显降低,高脂喂养提高了全血黏度水平,升高了血清ET-1水平,提示高血脂症对异常FSS模型的动脉粥样硬化有促进和预示作用。5.2当归补血汤对异常FSS动物模型动脉As病变的作用及机制研究本实验通过建立异常FSS动物模型动脉粥样硬化病变,以及使用不同芪归比例的当归补血汤进行药物干预,发现当归补血汤能有效的改善低剪切应力诱导的动脉粥样斑块的形成。当归补血汤能够有效调节血脂,改善血流变学变化,降低ET-1产生,提高血流速度,从而恢复低剪切应力区域血流剪切应力。另外当归补血汤有效抑制了ICAM-1,VCAM-1,LOX-1及NF-κB蛋白在低剪切应力区域血管组织上的表达。通过分离提取给药后的兔外周血内皮祖细胞,我们还发现当归补血汤能有效改善EPCs功能。实验结果表明芪归比例5:1组药效最明显,随着芪归比例的降低,药效随之下降。以上结果证明当归补血汤在异常剪切应力环境中发挥抗As功能可能与其调节血脂,改善血流变学变化,提高血流量,保护EPCs及抗炎症反应的作用密切相关,并且不同芪归比例的药效具有明显的差别,其中芪归比例5:1组药效最明显。6创新点首次探讨了异常FSS环境中不同黄芪当归比例的当归补血汤对血管内皮功能的保护,拓展了生物力学结合中医药抗As研究的新思路。7不足与展望随着现在各学科领域的快速发展,当归补血汤治疗As的现代研究正在不断汲取新的思路和技术,由于本人能力有限,另外当归补血汤具有多靶点的内皮保护途经,可能通过其他途径发挥治疗As作用,有待于进一步深入研究。