论文部分内容阅读
目的:乙肝病毒(Hepatitis B virus,HBV)感染与肝细胞肝癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)的发生发展关系密切。在中国,乙肝病毒感染为肝细胞肝癌的最常见病因。由于肝细胞肝癌的生存率较低,而复发率和致死率高,使其成为最难以诊断及治疗的癌症之一。转录因子NFAT5(Nuclear factor of activated T-cells 5)目前已被证实可被渗透压调控,并且在部分肿瘤中为促癌基因。本文主要对于NFAT5在肝癌发生发展中的作用和渗透压的关系,及NFAT5对乙肝相关性肝癌的调控机制进行了深入的研究,为乙肝相关性肝癌的早期诊断和治疗提供了新的思路。方法:我们首先使用RT-qPCR检测了 NFAT5在肝癌及癌旁组织中的mRNA表达量,并且运用免疫组织化学(IHC)验证了 NFAT5在肝癌及癌旁组织中的蛋白表达水平。此后运用RT-qPCR及Western Blot(WB)检测了 NFAT5在不同细胞系中的表达,以及NFAT5在不同渗透压下的表达水平。我们运用流式细胞术检测NFAT5对肝癌细胞凋亡的影响,同时使用WB检测了凋亡相关蛋白的表达变化。通过Transwell侵袭试验和细胞划痕试验研究了 NFAT5对肝癌细胞侵袭性的影响,同时检测了侵袭相关的蛋白水平变化。同时,我们使用流式细胞术检测NFAT5对细胞周期的调控。此后,我们通过生物信息学分析(KEGG,Targetscan),寻找NFAT5上游的调控因子,通过WB,PCR以及电化学发光法免疫分析技术检测了 miR-30e-5p与HBV的相关性。随后运用WB验证了 MAPK通路的蛋白表达量。通过ChIP-PCR技术,我们验证了 c-Myc与NFAT5启动子的关系。此后,我们使用ChIP-Seq技术对NFAT5下游的靶基因进行了预测,通过干扰以及过表达NFAT5验证DARS2的表达量从而研究NFAT5与DARS2的相互关系。同时使用WB,IHC及RT-qPCR验证DARS2在肝癌中的表达水平,以及WB及RT-qPCR检测DARS2在细胞水平的变化。流式细胞术检测DARS2对肝癌细胞周期及细胞凋亡的影响,同时WB评估周期及凋亡相关蛋白的表达变化。此后,收集临床数据,统计学分析临床相关指标与DARS2的相关性,并使用SPSS进行ROC曲线绘制,KM生存分析以及COX回归分析。结果:本研究中,我们证明NFAT5在肝癌中为抑癌基因,并且受渗透压调控。此外,NFAT5可抑制肝癌细胞的细胞周期进程,侵袭力以及促进肝癌细胞凋亡。同时,高渗透压可上调NFAT5,作为肝细胞肝癌的保护性因素。此后,我们研究了 NFAT5在乙肝相关性肝癌(HBV-associatedHCC)的调控机制。我们发现,HBV可通过抑制miR-30e-5p进而下调NFAT5。同时,miR-30e-5p亦可反向抑制HBV的活动。但miR-30e-5p上调NFAT5并非直接作用于NFAT5 mRNA的3 ’UTR(untranslatedregion,非翻译区),而是通过抑制MAPK通路中的转录因子MAP4K4进而上调NFAT5。此后,我们利用染色质免疫共沉淀及第二代测序技术(Chromatin immunoprecipitation and next generation sequencing,ChIP-seq)预测NFAT5的下游基因,发现DARS2目前在肝癌中功能未知。通过研究,我们证实DARS2在肝癌中为促癌基因,并且促进细胞周期进程以及抑制肝癌细胞凋亡,并且与多项临床指标相关。结论:NFAT5在肝癌中为抑癌基因,且受高渗透压上调。HBV通过抑制miR-30e-5p/MAPK/NFAT5通路来上调DARS2,进而促进HCC的肿瘤发生。该研究的结果为乙肝相关性肝癌的发生发展及NFAT5的调控机制提出了新的观点。