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血吸虫病是一种世界性分布的人畜共患寄生虫病,对人类和哺乳动物健康造成极大威胁。血吸虫病在我国主要流行于长江以南部分山地和沼泽地区,目前中国血吸虫病研究的重点是阐明日本血吸虫生长发育机制,寻找其中关键的信号分子、酶和受体等,为新型疫苗和药物的开发提供依据。相关人员利用生物信息学方法预测日本血吸虫体内存在Wnt信号通路,该信号通路作用机制高度保守,参与调控多种生理学过程。前期研究克隆了日本血吸虫首个Wnt家族基因Wnt4,该基因在哺乳动物体内主要参与调控生殖器官发育,但该基因在日本血吸虫虫体生长发育中是否有类似作用及发挥作用的分子机制需要进一步阐明。本文以揭示日本血吸虫Wnt4分子的作用机制为目标,分析了Wnt4基因的结构特征及其在不同发育阶段虫体转录水平的变化;制备了抗Wnt4血清,对该蛋白进行虫体定位;利用RNAi技术证明Wnt4信号分子通过经典Wnt/β-catenin信号通路参与调控虫体表皮生长和雌虫产卵过程;克隆了日本血吸虫经典Wnt信号通路的关键分子β-catenin基因cDNA序列,分析了其典型结构特征和不同发育阶段转录水平的变化。1. Wnt4基因的结构特征和不同发育阶段虫体转录水平变化以限制性内切酶消化的日本血吸虫基因组DNA为模板,构建GenomeWalkerTM文库;设计特异引物扩增Wnt4基因的DNA片段,与其cDNA序列进行比对,证明Wnt4基因序列包含4个外显子和3个内含子。以18S rRNA为内参,通过实时定量PCR分析Wnt4基因在虫卵、发育早期阶段童虫和23日龄雌、雄虫的转录水平相对较高。2.抗Wnt4血清的制备和Wnt4蛋白的组织定位以Wnt4基因的部分cDNA序列为目的片段,设计特异引物进行PCR扩增;将PCR产物和pET28a（+）载体分别进行双酶切后连接,构建pET28a-Wnt4-156重组质粒,诱导表达Wnt4原核蛋白片段;以纯化蛋白为抗原,免疫BALB/c小鼠,制备抗Wnt4血清;Western blotting验证该血清能够和虫体Wnt4蛋白特异结合。以制备的抗血清为一抗,免疫组化分析表明该蛋白在32日龄成虫的生殖器官（雄虫睾丸和雌虫卵巢）并无分布,而是主要定位于13日龄童虫、18日龄童虫和32日龄成虫体壁下的肌肉细胞层,且随着日龄增多,蛋白量有下降趋势,推测该蛋白对虫体生殖系统的调控作用并不显著,可能参与表皮相关的发育过程。3. RNA干扰技术研究Wnt4信号分子的作用通路利用在线RNA干扰软件设计4个候选siRNA分子,荧光显微镜观察电击法能够将FAM标记的siRNA导入虫体;用电击法筛选干扰效果最好的siRNA,作为应用干扰小分子;比较了电击法和浸泡法对Wnt4基因的抑制水平,表明电击法和浸泡法均能有效抑制目的基因的表达,但电击法引起的抑制效果约是浸泡法的2倍;剂量分析表明50μg和40μg siRNA引起的抑制效果无统计学差异,但50μg剂量能够引起虫体大量死亡,因此在下游基因分析中采用40μg作为应用剂量。根据预测的日本血吸虫Wnt信号通路,分别选择3条通路的6个下游基因,以干扰后体外培养7 d的虫体为研究对象分析下游基因表达量的变化。结果表明试验组虫体β-连环蛋白（β-catenin）和糖原合成酶激酶3β（GSK-3β）的mRNA水平分别下降了45%和39%,这两个基因是经典Wnt信号通路的下游基因,其它4个基因的mRNA水平无明显变化,证明Wnt4分子通过经典的Wnt/β-连环蛋白信号通路起作用。Western blotting分析表明试验组虫体Wnt4和β-连环蛋白的蛋白水平也明显下降。4. Wnt4信号分子在虫体发育过程中的作用将干扰siRNA导入新转化童虫,使童虫在小鼠体内完成发育过程。分析表明试验组和对照组虫体的发育率和合抱率无显著差异,但试验组雌、雄虫的体长明显小于对照组雌、雄虫,试验组小鼠肝脏荷虫卵率明显低于对照组小鼠。推断Wnt4信号分子在虫体发育过程中的作用之一是调控虫体表皮细胞生长和雌虫产卵过程。5.β-连环蛋白基因cDNA序列的扩增和不同发育阶段虫体转录水平的变化通过RACE技术得到日本血吸虫经典Wnt信号通路的关键分子β-连环蛋白基因的全长cDNA序列（GU570442）,在线软件分析该蛋白有β-连环蛋白家族蛋白典型的ARM结构特征。实时定量PCR分析表明该基因在不同发育阶段虫体转录水平变化趋势和Wnt4基因有相似性。以上研究证明在日本血吸虫体内Wnt4信号分子通过经典的Wnt/β-连环蛋白信号通路参与调控虫体表皮生长和雌虫产卵过程,Wnt4信号分子作用机制的阐明为研究日本血吸虫的生长发育机制和寻找新的药靶位点提供了新的思路和研究方向。