核转录因子κB(nuclear factor of kappa B,NF-κB),在机体天然免疫反应(innate immunity)以及细胞存活等生命活动中发挥着重要作用。细胞在静息状态下,NF-κB与其抑制蛋白IκB(inhibitor of kappa B)相互结合,IκBα通过将NF-κB的核定位序列(nuclear localization sequence,NLS)掩盖而使其定位在细胞浆中。当细胞受到外界因素如肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor,TNFα)的刺激时,TNF 受体相关因子 2(TNF receptor-associated factor 2,TRAF2)将 TGFβ 激活激酶 1(TGFβ activated kinase 1,TAK1)募集到 TNF 受体 1(tumor necrosis factor receptor 1,TNFR1),与此同时,细胞内的 IκB 激酶(IκB kinase,IKK)复合物也被TRAF2募集而来,当这些信号分子被募集到一起时,TAK1催化IKK激酶的磷酸化激活,被激活的IKK激酶进一步催化其下游IκBα蛋白的磷酸化修饰,促进其发生泛素化修饰而通过26S蛋白酶体途径被降解,从而将与其结合的NF-κB释放出来,NF-κB再在核定位信号的作用下移位入核,激活其下游靶基因的表达。IKK激酶复合物由两个催化亚基IKKα、IKKβ以及一个调节亚基IKKγ(NEMO)所构成。在典型(canonical)的NF-κB信号转导通路中,IKKα/IKKβ的激活对于IκBα的磷酸化和泛素化修饰以及NF-κB下游靶基因的激活起着至关重要的作用。而近年来的研究也表明其在肿瘤的发生与发展、细胞增殖与凋亡调控中均发挥着重要的作用,因此研究其在细胞中激活的调控机制有望为炎症相关疾病的防治提供新的策略与靶标。人类基因组共编码42种Kelch-like(KLHL)家族蛋白,它们都包含一个BTB(bric-a-brac,tramtrack and broad complex 结构域、一个 BACK 结构域以及5～6个重复的Kelch结构域,且其蛋白质序列在进化上高度保守。到目前为止,该家族的绝大多数成员的功能并不清楚。但已有的研究表明,部分KLHL家族蛋白在细胞中可通过与Cullin3蛋白结合形成E3泛素连接酶,催化底物蛋白质的泛素化修饰。而KLHL21作为该蛋白家族的一员,也可以通过与Cullin3蛋白相互结合形成有功能的E3泛素连接酶,在细胞中催化Aurora B蛋白激酶的泛素化修饰,参与细胞有丝分裂的调控。我们的前期研究发现KLHL21可以通过与IKKβ相互作用而抑制TNFα刺激诱导的IκBα蛋白的磷酸化修饰和降解,抑制p65(RelA)的移位入核,从而抑制NF-κB信号转导通路的激活。但是KLHL21是如何通过和IKKβ蛋白的相互作用而抑制NF-κB的激活,以及其在NF-κB信号转导通路中的调控作用,目前尚不清楚。因此,本研究进一步分析了 KLHL21通过与IKKβ的相互作用抑制NF-κB信号转导通路机制及其生物学意义。一、进一步验证了 KLHL21和IKKβ之间的相互作用:首先采用免疫共沉淀(co-immunoprecipitation,CO-IP)实验证实了小鼠单核巨噬细胞RAW264.7和人胚肾细胞293T(human embryonic kidney,HEK)中内源性的KLHL21与IKKβ之间存在相互作用。其次,原核表达并纯化了 GST-KLHL21融合蛋白,通过GST-pull down实验进一步证实GST-KLHL21融合蛋白与RAW264.7和HEK293T细胞中内源性IKKβ之间存在相互作用,提示KLHL21在细胞中和IKKβ可能存在直接的相互作用。最后,通过免疫荧光共定位实验验证了在HeLa细胞中内源性IKKβ与含有mCherry标签的KLHL21蛋白存在共定位。这些结果清楚地表明KLHL21和IKKβ蛋白之间存在相互作用。为了进一步了分析KLHL21和IKKβ之间的相互作用是否受到外界因素刺激如TNFα的影响,我们在HEK293T细胞中共表达了 C末端含有EE标签的IKKβ(IKKβ-EE)和 C 末端含有 3 个 FLAG 标签的 KLHL21(KLHL21-3F),转染24 h后采用20 ng/ml TNFα分别刺激0 min、10 min和30 min,通过免疫共沉淀实验分析发现IKKβ和KLHIL21蛋白之间的相互作用随着TNFα刺激时间的延长而减弱。二、鉴定了 KLHL21和IKKβ蛋白分子中参与相互作用的结构域:IKKβ蛋白含有一个激酶结构域(Kinase Domain,KD)、一个泛素样结构域(Ubiquitin Like Domain,ULD)、一个 α 螺旋支架/二聚体化结构域(Scaffold/Dimerization Domain,SDD)和一个 NEMO 结合结构域(NEMO-binding domain,NBD)。为了鉴定参与和KLHL21蛋白相互结合的结构域,我们首先构建了 5种分别缺失上述一个或多个结构域的IKKβ截短突变体。然后将全长IKKβ以及5种截短突变体分别与全长KLHL21蛋白共表达于HEK293T细胞中,免疫共沉淀实验结果表明IKKβ是通过其激酶结构域(KD)与KLHL21发生相互结合。同样,本研究构建了 4种包含不同结构域的KLHL21截短突变体以及点突变体KLHL21M(D114A/L115A/Q117A,突变位点位于BTB结构域中,不能和Cullin3蛋白相互结合),分别将全长KLHL21以及4种截短突变体和KLHL21M与全长IKKβ蛋白表达载体共转染HEK293T细胞,免疫共沉淀实验结果揭示KLHL21是通过其Kelch结构域和IKKβ发生相互作用。此外,KLHL蛋白家族成员KEAP1也可以通过其Kelch结构域与IKKβ的KD结构域中特定的E(T/S)GE模体相互结合。为了分析KLHL21是否也是通过其Kelch结构域与该模体相互结合,本研究将该模体中的E39突变为甘氨酸残基,免疫共沉淀实验结果显示IKKβE39A突变体不能与KEAP1相互结合,但不影响其与KLHL21蛋白的相互作用,表明KLHL21蛋白是结合到IKKβ的KD结构域中的其他区域,也进一步证实了 IKKβ和KLHL21蛋白之间相互作用的特异性。三、KLHL21抑制IKKβ激酶的激活。为了分析KLHL21在细胞中抑制IKKβ激酶的机制,本研究首先在HEK293T细胞中共表达KLHL21、KLHL21M、IKKβ和Ub,然后采用蛋白酶体抑制剂MG132(5 μmol/L)处理16 h,免疫印迹实验结果显示KLHL21和KLHL21M均不能促进IKKβ发生泛素化修饰,表明KLHL21在细胞内不是IKKβ蛋白的特异性E3泛素连接酶。进一步的研究揭示:共表达KLHL21与KLHL21M均可显著抑制由过表达诱导的IKKβ自磷酸化激活,而且过表达KLHL21可以抑制20 ng/mlTNFα刺激诱导的IKKβ蛋白的激活,而采用siRNA抑制HEK293T细胞中内源性的KLHL21蛋白的表达则可上调TNFα刺激诱导的IKKβ蛋白的磷酸化水平。以上结果清楚的表明:KLHL21蛋白可以抑制IKKβ的磷酸化激活,而且其在细胞中的这种功能并不依赖于其E3泛素连接酶的活性。为了进一步分析KLHL21抑制IKKβ的激活是否是通过干扰其与TRAF2、TAK1或IκBα之间的相互作用来实现的,本研究将KLHL21和IKKβ共表达于HEK293T细胞,免疫共沉淀分析的结果表明:过表达KLHL21并不影响TRAF2、TAK1或IκBα和IKKβ之间的相互作用。四、KLHL21差异性地调控NF-κB下游靶基因的表达。为了进一步分析KLHL21对NF-κB信号转导通路的影响,我们在HEK293T细胞中过表达KLHL21,给予浓度为20ng/mlTNFα刺激,不同时间点(0h、0.5h、2h、4h)收集细胞,然后采用real-time PCR分析NF-κB下游靶基因表达水平的变化。结果显示:过表达KLHL21可以抑制TNFα刺激诱导的NFKBIA(编码IκBΑ)的表达,但却上调IL-8(2 h和4 h)与TNFAIP3(4h)mRNA的表达。而采用siRNA干扰KLHL21的表达则上调TNFΑ刺激诱导的NFKBIA的表达、下调IL-8(2h和4 h)的表达,对TNFAIP3的表达没有明显的影响。与此相一致的是,采用sIRNA干扰RAW264.7细胞中KLHL21的表达可上调脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)刺激诱导的NFKBIA的表达水平,而下调IL-IB和TNLA1P3的表达水平,提示KLHL21在细胞中对NF-κB靶基因的表达可能具有基因差异性。为了分析产生这一现象的原因,本研究在HEK293T细胞内过表达KLHL21,转染24 h后给予浓度为20ng/mlTNFΑ刺激,不同时间点(0h、2h、4h)收集细胞,采用细胞的核质分离技术分析了细胞核内p65蛋白的水平,结果表明:过表达KLHL21延长p65蛋白在细胞核内的滞留时间(4 h),这极有可能是其上调相对晚期表达基因如IL-8、TNFAIP3表达水平的主要原因。综上所述,本研究通过实验进一步揭示了 KLHL21可通过其Kelch结构域和IKKβ的KD结构域发生相互作用,通过直接抑制IKKβ的磷酸化激活而差异性的调控NF-ΚB下游靶基因的表达。本研究取得以下结果:1.在RAW264.7与HEK293T细胞中,内源性的KLHL21蛋白和内源性的IKKβ存在相互作用;GST-pull down实验进一步证实了 KLHL21和IKKβ之间的相互作用,提示它们在细胞内可能存在直接相互作用;免疫荧光实验表明在HeLa细胞内IKKβ和KLHL21存在共定位;而TNFΑ刺激可时间依赖性的减弱IKKβ和KLHL21之间的相互作用;2.分别成功构建了 IKK3和KLHL21蛋白的不同结构域缺失的截短突变体,通过免疫共沉淀实验鉴定了 IKKβ通过其KD结构域和KLHL21的Kelch结构域发生相互作用;成功构建了 IKKβ的E39A突变体,免疫共沉淀实验结果显示:KLHL21不是通过与IKKΒ激酶结构域上的E(T/S)GE模体发生相互作用,表明KLHL21和IKKβ蛋白之间的结合具有特异性;3.过表达KLHL21以及KLHL21M均不能促进IKKβ发生泛素化修饰,表明其在细胞内不是IKKβ的特异性的E3泛素连接酶;过表达KLHL21能抑制由过表达诱导的IKKβ的自磷酸化激活与TNFΑ刺激诱导的IKKβ的激活,而干扰KLHL21可以促进由TNFΑ刺激诱导的IKKβ的磷酸化激活;4.过表达KLHL21蛋白不会干扰TRAF2、TAK1以及IΚBΑ和IKKβ之间的相互作用;5.HEK293T细胞内过表达KLHL21可下调TNFα刺激诱导的NFKBIA的mRNA表达水平,但可上调IL8(2 h和4 h)以及TNFAIP3(4 h)的表达水平;而采用siRNA干扰HEK293T细胞内KLHL21的表达则可以上调由TNFα诱导引起的NFKBIA的表达水平,下调在IL8(2h和4h)的表达水平,而对TNFAIP3没有影响;与此相似,采用siRNA干扰RAW264.7细胞中KLHIL21的表达,同样可以上调由LPS刺激引起的NFKBIA的表达水平,下调TNFAIP3(4h)和IL-B(0.5 h和4h)的表达水平。进一步的分析显示:KLHL21对NF-κB下游靶基因的这种差异性调控可能是由于过表达KLHL21可以延长在p65蛋白在核内的滞留时间所致。