研究背景膀胱癌是人类最常见恶性肿瘤之一,占全部恶性肿瘤的3.2%,其发病率呈逐年上升的趋势,而膀胱癌也是泌尿系肿瘤中最常见的恶性肿瘤之一。美国癌症协会统计,在2006年膀胱癌在美国男性恶性肿瘤中排名第四位,在女性恶性肿瘤中排名地九位。在我国泌尿系肿瘤中,膀胱癌的发生率和病死率也处于首位。膀胱癌包括多种病理类型,其中最常见的是膀胱移行细胞癌。膀胱癌可以分为非肌层浸润性膀胱癌和肌层浸润性膀胱癌。浸润和转移是膀胱癌的主要生物学特性。研究膀胱癌的浸润转移机制将有助于进一步的了解认识膀胱肿瘤的发生、发展过程,这将对膀胱移行细胞癌的治疗和预后提供更多更重要的理论基础。目前对膀胱移行细胞癌发病机制的研究已经取得重大的进展,对膀胱移行细胞癌的诊断和治疗也取得重大的发展。然而浸润和转移依然是癌症治疗的难点,也是导致患者死亡的主要原因。研究表明上皮间质转化与膀胱癌的发生发展关系密切。因此进一步的探讨学习上皮间质转化的过程有利于进一步的研究认识膀胱癌的进展过程,有利于指导膀胱癌的预防和治疗。上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)是指来源于上皮的肿瘤细胞,在特定的病理和生理情况下失去极性并向间充质细胞转化的生物学过程,主要表现为上皮细胞粘附减少,上皮细胞极性的消失,使细胞的侵袭和转移能力增强,同时细胞表型发生改变,获得了间质细胞表型。上皮间质转化是来源于上皮的恶性肿瘤细胞获得侵袭和转移能力的重要生物学过程。E-钙黏蛋白(E-cadherin)和N-钙黏蛋白(N-cadherin)分别是上皮细胞和间质细胞的分子生物标志物,都是上皮间质转化的分子标志物。上皮间质转化的过程,简单的说就是E-钙黏蛋白表达逐渐减少,而N-钙黏蛋白表达逐渐增加的过程。目前认为,上皮间质转化在膀胱肿瘤的发生发展中发挥着及其重要的作用。上皮间质转化的发生发展是一个多基因、多步骤、多阶段的复杂的过程。大量的研究已经显示了E-钙黏蛋白和N-钙黏蛋白在上皮间质转化中的作用,及其与肿瘤的侵袭和转移的关系。对上皮间质转化的研究也取得了重大的进展,然而很少有文章报道对E-钙黏蛋白和N-钙黏蛋白的双阴性表达的肿瘤细胞特性的研究及推测其与上皮间质转化的关系。曾经有文章报道在检测E-钙黏蛋白和N-钙黏蛋白在非肌层浸润性膀胱癌的组织标本中的表达情况时,可检测到有E-钙黏蛋白阴性表达和N-钙黏蛋白阴性表达的现象存在,然而并未明确指出有E-钙黏蛋白和N-钙黏蛋白双阴性表达的癌细胞存在及对其特性进行研究,也并未探讨其与上皮间质转化的关系。因此我们猜想：是否来源于上皮的膀胱移行细胞癌组织中都有E-钙黏蛋白和N-钙黏蛋白双阴性表达的癌细胞存在呢?而这样一种膀胱癌细胞它的生物学特性又是这么样的呢?与上皮间质转化有没有关系呢?在本课题中,我们着重研究了E-钙黏蛋白和N-钙黏蛋白双阴性表达的膀胱移行细胞癌细胞的生物学特性,并探讨其与上皮间质转化的关系,进一步深化了解上皮间质转化的发生发展过程,加深了对膀胱肿瘤的发生发展过程的了解。目的：1、检测证实膀胱移行细胞癌组织中有E-钙黏蛋白和N-钙黏蛋白双阴性表达的癌细胞存在。2、探讨E-钙黏蛋白和N-钙黏蛋白双阴性表达的膀胱移行细胞癌细胞的生物学特性。3、推测E-钙黏蛋白和N-钙黏蛋白双阴性表达的现象与上皮间质转化的关系。方法：1、用组织免疫荧光实验检测E-钙黏蛋白和N-钙黏蛋白在膀胱尿路上皮癌组织中的表达。2、用免疫蛋白印迹实验(western blotting)和细胞免疫荧光实验(immunofluorescence assay)分别检测E-钙黏蛋白和N-钙黏蛋白在膀胱尿路上皮癌细胞株(5637细胞株,UMUC-3细胞株,EJ细胞株)中的表达情况。3、细胞功能特性比较：用细胞增殖实验(CCK8)检测三株膀胱尿路上皮癌细胞(5637细胞株,UMUC-3细胞株,EJ细胞株)体外增殖能力；用平板克隆形成实验检测癌细胞克隆形成能力；用Transwell实验分别检测癌细胞的迁移和侵袭能力；用动物实验检测癌细胞在免疫缺陷小鼠皮下成瘤能力。结果：1、E-钙黏蛋白、N-钙黏蛋白在膀胱移行细胞癌组织中的表达组织免疫荧光结果显示在低级别、中级别和高级别肌层浸润性膀胱移行细胞癌组织中均检测到E-钙黏蛋白和N-钙黏蛋白双阴性表达的细胞存在。其中红色荧光代表E-钙黏蛋白的表达,绿色荧光代表N-钙黏蛋白表达,蓝色荧光代表细胞核。2、E-钙黏蛋白、N-钙黏蛋白在膀胱尿路上皮癌细胞株(5637细胞,UMUC-3细胞,EJ细胞)中的表达免疫蛋白印迹实验和细胞免疫荧光实验结果共同显示5637细胞株为E-钙黏蛋白阳性表达和N-钙黏蛋白阴性表达；UMUC-3细胞株为E-钙黏蛋白和N-钙黏蛋白双阴性表达；EJ细胞株为E-钙黏蛋白阴性表达和N-钙黏蛋白阳性表达。3、细胞功能特性比较(1)、体外增殖实验结果表明,5637细胞、UMUC-3细胞及EJ细胞三组间相比较细胞间的体外增殖能力差异显著(F=308.583；P<0.01)；不同时间点对细胞体外增殖能力的影响差异具有显著性(F=1513.910；P<0.01)；各组细胞与各时间组两因素之间交互效应显著(F=58.889；P<0.01)。除了第一天(F=0.553,；P=0.602)、第二天(F=1.078；P=0.398)外,其他各时间点细胞组间的细胞增殖差异具有显著性。体外增殖实验结果显示UMUC-3细胞的体外增殖能力强于5637细胞,两者差异显著(P<0.05),但是弱于EJ细胞,两者差异显著(P<0.05)。(2)、平板克隆形成实验结果显示5637、UMUC-3与EJ细胞株间克隆形成能力差异显著,差异有统计学意义(F=203.304, P<0.01); UMUC-3细胞比5637细胞能够形成更大更多的克隆球(5637细胞组克隆形成率为5%,UMUC-3细胞组克隆形成率为15.38%,P<0.05),然而与EJ细胞相比较,所形成的克隆球较小、数量较少(UMUC-3细胞组克隆形成率为15.38%,EJ细胞组克隆形成率为24.25%,P<0.05)；(3)、Transwell迁移实验结果显示5637、UMUC-3与EJ细胞株间细胞迁移能力差异显著,差异间有统计学意义(F=1523.776,P<0.01)；UMUC-3细胞的迁移能力显著强于5637细胞,差异显著(P<0.05),然而弱于EJ细胞,差异显著(P<0.05)；(4)、Transwell侵袭实验结果也显示5637、UMUC-3与EJ细胞株间细胞侵袭能力差异显著,差异间有统计学意义(F=2161.376,P<0.01)；UMUC-3细胞的侵袭能力显著强于5637细胞,两者差异有统计学意义(P<0.05),与EJ细胞相比较,明显弱于EJ细胞,两者差异显著(P<0.05)；(5)、裸鼠皮下移植瘤实验结果显示：三组细胞(5637、UMUC-3及EJ细胞)在7个时间点的皮下瘤体积的总体差异有显著性(F=23.903；P<0.01)；每组细胞皮下瘤体积随着时间的增长而逐渐增大,在时间水平细胞之间的皮下肿瘤体积总体差异有统计学意义(F=16.295；P<0.01)；且细胞与天数之间的交互效应具有统计学意义(F=2.372；P<0.01)。5637细胞皮下成瘤数目比较少,成瘤速度比较慢,肿瘤体积也比较小,随着时间推移5637细胞组皮下肿瘤体积变化差异无统计学意义(F=2.292；P=0.138)。而UMUC-3细胞及EJ细胞皮下成瘤能力都比较强,随着时间的增长UMUC-3细胞组皮下瘤体积变化差异有统计学意义(F=12.210；P<0.01),且随着时间变化EJ细胞组皮下瘤体积大小变化也有统计学意义(F=11.348；P<0.01),其中EJ细胞皮下瘤生长能力最强。两两比较的结果显示：从第12天开始,不同细胞组间裸鼠皮下瘤生长能力开始出现显著差异(P<0.05)。皮下瘤实验结果表明：UMUC-3细胞组皮下成瘤能力强于5637细胞组,但是弱于EJ细胞组。病理组织切片HE染色结果显示组织形态学与肿瘤形态学相似。结论：1、在膀胱移行细胞癌组织中有E-钙黏蛋白和N-钙黏蛋白双阴性表达的癌细胞存在。2、E-钙黏蛋白和N-钙黏蛋白双阴性表达的膀胱移行细胞癌细胞的生物学特性强于E-钙黏蛋白阳性表达和N-钙黏蛋白阴性表达的膀胱移行细胞癌的细胞,但是弱于E-钙黏蛋白阴性表达和N-钙黏蛋白阳性表达的膀胱移行细胞癌细胞的生物学特性。3、E-钙黏蛋白和N-钙黏蛋白双阴性表达的现像有可能参与膀胱移行细胞癌病理机制中的上皮间质转化过程。本研究的创新之处：1、进一步指出膀胱移行细胞癌中有E-钙黏蛋白和N-钙黏蛋白双阴性表达的癌细胞存在；2、探讨了E-钙黏蛋白和N-钙黏蛋白双阴性表达的膀胱移行细胞癌细胞的生物学特性。3、推测了膀胱移行细胞癌细胞E-钙黏蛋白和N-钙黏蛋白双阴性表达的状态与上皮间质转化之间是否存在关系。