目的不动杆菌属(Acinetobacter)是一类无芽胞,不能运动的革兰阴性杆菌。近年来,因该类细菌在医院感染中越来越多见,且多重耐药(MDR)菌株的比例迅速增加,从而引起公众的关注。规律成簇间隔的短回文重复序列(CRISPR)是广泛存在于古生菌和细菌基因组中的、针对外来入侵元件的适应性免疫系统。细菌一方面为了物种的稳定进化出CRISPR系统等机制以抵御外来基因的干扰,另一方面在生存压力下而需要通过水平基因转移(HGT)从外界获得新的基因以适应新的环境。本文旨在通过对不动杆菌CRISPR系统基因结构的分析,以深入理解细菌如何协调二者的矛盾。方法本文将从两个不同角度(NCBI数据库已公布的菌株以及我们收集获得的临床分离株)分析不动杆菌CRISPR系统的基因结构并初步探讨其与耐药之间的关系,并且对两部分结果进行对比分析。不动杆菌各菌株CRISPR阵列等相关序列信息收集自CRISPRdb数据库,基因序列下载自NCBI的Nucleotide数据库。使用Meg Align软件对其重复序列(Repeat Sequence)进行比较归类,将最终分类结果输入到CRISPRmap软件中进行分析,预测并比较所形成RNA二级结构和最小自由能(MFE)。通过Weblogo结果分析其保守性;在Gen Bank数据库中对所有的间隔序列进行Blastn分析,寻找与其序列同源的外源基因元件(一致性≥85%,覆盖率≥85%);将CRISPR阵列中第一个重复序列上游与cas基因之间的一段序列作为前导序列(Leader Sequence)查找的位点,长度设定为100bp,使用Weblogo等软件在线分析预测前导序列的保守性,并且通过promoter 2.0预测启动子存在的可能性;cas基因序列通过MEGA7.0软件进行比对,并且做系统进化树分析。根据CRISPR阵列与cas相关蛋白基因位点的相关信息绘制各菌株CRISPR-Cas系统结构图;然后根据cas基因的类型和组成对不动杆菌的CRISPR系统进行分型。MLST数据库搜索对应的等位基因谱及序列型;以Genomes数据库公布的141株具有完整基因组序列及基因注释的不动杆菌为研究对象,查找其基因组中氨基糖苷类修饰酶编码基因APH、ACC等在内的8类常见耐药基因,进一步统计分析耐药基因的携带情况(耐药基因型)与CRISPR之间的关系。此外,我们从青岛多家三甲医院检验科收集到105株不动杆菌临床分离株,通过体外药物敏感试验检测其耐药性;根据第一部分的部分结果设计I-Fa和I-Fb的引物,PCR扩增cas1基因并对其进行分型;然后通过SPSS 13.0软件进行统计学处理,分析、探讨临床株CRISPR系统的携带情况与耐药表型之间的关系。结果1.本研究利用生物信息学方法探究了NCBI数据库中收录的185株不动杆菌的CRISPR系统的基因结构,以及推测每个组成部分的潜在功能。我们共鉴定出397个确定CRISPR阵列,发现了72种不同的重复序列,且发现种内重复序列比较保守且多含有motifs,可以形成稳定的RNA二级结构。9.7%的间隔序列与噬菌体和质粒相关的外来基因元件序列高度同源。另外,38.4%的间隔序列与其他细菌CRISPR阵列以外的基因组的某些序列具有一定的一致性。更有意思的是16.7%的间隔序列与真核生物基因组的某些序列具有一致性,后者多位于一些假设蛋白的编码基因中。通过对cas基因的组成、结构和序列分析发现,不动杆菌的CRISPR系统类型几乎都归类到IF型中,其中I-Fa型39%,I-Fb型59%,其他为未定型和III-A型。Cas相关蛋白基因(cas1、cas3、csy2、csy3、csy4)的系统进化分析结果高度相似,且分支上的菌株大致相同。此外,首次发现cys1基因仅存在于I-Fb亚型的菌株中,而在I-Fa亚型中不存在该基因。同一CRISPR系统亚型大多数具有相同MLST类型。通过对Genomes数据库141株不动杆菌全基因组耐药基因的分析发现,无CRISPR阵列不动杆菌组的某些耐药基因的携带率显著高于有CRISPR系统(包括可疑结构)组。2.对105株不动杆菌临床株的标本来源分析发现,下呼吸道的分离标本居多。cas1基因PCR扩增结果阳性率是23.8%,其中I-Fb 9.5%,I-Fa型14.3%,略高于第一部分研究中不动杆菌基因组中的cas1的阳性率(其中,CRISPRdb中不动杆菌cas1的阳性率为17.5%;而Genomes数据库中的cas1的阳性率则为20.6%)。cas1的存在可能会影响不动杆菌对头孢哌酮/舒巴坦、头孢吡肟、亚胺培南和环丙沙星的耐药性。由此确定CRISPR与不动杆菌耐药性存在着必然联系。结论本研究结果显示:1.CRISPRdb数据库中不动杆菌的CRISPR阵列的携带率为21.3%,cas基因的携带率为17.5%,低于文献报道的多数临床常见细菌中的携带率。不动杆菌CRISPR系统的重复序列在种内保守性较高,且多可以形成稳定的RNA二级结构。部分间隔序列与噬菌体和质粒等高度同源。不动杆菌基因组中的CRISPR系统几乎都属于I-F型,且可分为I-Fa和I-Fb两个亚型。首次发现csy1基因的存在可作为不动杆菌CRISPR系统分亚型依据;此外,cas3、csy2、csy3、csy4等基因序列也均可独立作为分亚型的依据。2.临床株耐药率研究结果表明不动杆菌耐药形势非常严峻,CRISPR阵列或cas基因的存在与不动杆菌的某些耐药基因或耐药表型之间关系密切。