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[目的]:构建能在真核细胞内高效表达KiSS-1和P27kip1基因的共表达质粒pIRES- KiSS-1- P27kip1,纯化能同时分别稳定表达KiSS-1基因、P27kip1基因、KiSS-1和P27kip1基因的骨肉瘤MG-63细胞株,分别从mRNA和蛋白质水平检测各细胞组中KiSS-1和P27kip1基因的表达水平,并研究共表达腺病毒载体介导的KiSS-1和P27kip1基因体外转染骨肉瘤MG63细胞后,对细胞生长增殖及细胞周期的影响。为进一步应用该共表达载体对骨肉瘤进行基因治疗的研究提供实验依据。[方法]:1、KiSS-1、P27kip1基因共表达载体的构建和测序鉴定。2、阳离子脂质体法介导KiSS-1基因和P27kip1基因分别或共转染骨肉瘤MG-63细胞,并通过G418筛选获得相应的细胞组。3、通过RT-PCR和Western blot法分别检测转染前后各组骨肉瘤MG63细胞KiSS-1和P27kip1基因转录和蛋白水平表达的变化情况。4、细胞增殖实验检测转染后各组骨肉瘤MG63细胞生长增殖能力变化。5、流式细胞仪检测转染前后各组骨肉瘤MG63细胞周期的变化。[结果]:1、KiSS-1、P27kip1共表达载体的构建:胎盘组织中抽提总RNA并通过RT-PCR分别获得各目的基因的ORF,将目的基因通过酶切、连接导入共表达载体pIRES中,送测序结果无误。2、阳性脂质体法分别介导pIRES-KiSS-1、pIRES-P27kip1、pIRES- KiSS-1- P27kip1转染骨肉瘤MG-63细胞株,经G418抗性筛选。获得稳定表达KiSS-1、P27kip1及KiSS-1和P27kip1的骨肉瘤MG-63细胞组。3、转染前后各骨肉瘤MG63细胞组的KiSS-1基因、P27kip1基因转录及蛋白表达水平有明显差异。4、共表达KiSS-1和P27kip1基因的骨肉瘤MG63细胞较表达KiSS-1或P27kip1基因的骨肉瘤MG63细胞出现生长增殖能力降低,并出现细胞周期明显阻滞于G1/S期。与空载体组比,pIRES-P27kip1MG63细胞和pIRES-KiSS-1MG63细胞均出现明显生长增殖能力降低,其细胞周期分别明显受阻滞于G1/S期和G2/M期。[结论]:1、利用脂质体将KiSS-1基因和P27kip1基因转染到骨肉瘤MG63细胞是可行有效、稳定的。2、pIRES-KiSS-1- P27kip1能够介导目的基因在骨肉瘤MG63细胞内稳定、有效地表达。3、与单基因转染后的骨肉瘤MG63细胞相比,双基因共表达转染后的骨肉瘤MG63细胞增殖能力受到更明显的抑制。4、联合KiSS-1基因、P27kip1基因治疗骨肉瘤可能成为骨肉瘤基因治疗的一种比较有效的方法。同时,为进一步联合KiSS-1基因和P27kip1基因治疗骨肉瘤提供了实验基础。