人类免疫缺陷病毒(HIV)感染及其引起的艾滋病,是我国及全球所面临的重大公共卫生问题,严重危害人类健康。开发研制安全有效的HIV疫苗以及抗HIV药物是控制HIV感染及艾滋病流行的重要措施。HIV-1反式转录激活因子(trans-activator of transcription, Tat)是HIV-1在感染早期产生的一种重要调节蛋白,在病毒复制和感染致病中起重要作用。在HIV感染细胞内,Tat可反式激活病毒基因组转录的起始和延长,从而启动和促进病毒的复制。此外,分泌和释放至细胞外的Tat还具有多样的胞外活性,在艾滋病的免疫抑制、艾滋病脑病和Kaposi肉瘤形成等病理过程中发挥重要作用,被称为“病毒毒素”,也已成为HIV疫苗研究的重要候选抗原之一。已有研究表明,尽管天然Tat蛋白的序列在HIV-1不同亚型毒株间具有高度的保守性,但其属非折叠蛋白,结构松散,使得天然Tat作为HIV疫苗的候选抗原,尚存在诱发的抗体尤其是免疫保护性抗体滴度低这一关键问题。因此,本研究根据天然Tat分子结构及其各功能区特点,构建并原核表达了多种HIV-1 Tat突变体重组蛋白,以期提高其构象稳定性、免疫原性并能诱导出高滴度和持久的保护性抗体。本研究分以下三个部分:第一部分HIV-1 HXB2株截短的Tat突变体蛋白的原核表达在分析Tat蛋白各功能区(N末端区(1-21aa)、半胱氨酸富集区(22-37aa)、核心区(38-48aa)、碱性氨基酸富集区(49-59aa)、谷氨酰胺富集区(60-72aa)以及C末端区(73-101aa))以及已有的研究工作基础上,本研究构建并原核表达了9种HIV-1 HXB2株截短的Tat突变体蛋白。具体方法如下:PCR方法分别获得tat1-21、tat1-37、tat1-61、tat1-72、tat1-86、tat22-86、tat38-61、tat22-101(a)、tat22-101(b)基因片段,用T/A克隆法将各片段克隆至pMD18-T载体进行测序。将测序正确的序列分别克隆到原核表达载体pPET-32a或pPEPTIDE2中,构建其原核表达质粒:pPEPTIDE2-tat1-21、pET-32a-tat1-37、pET-32a-tat1-61、pPEPTIDE2-tat1-72、pPEPTIDE2-tat1-86、pPEPTIDE2-tat22-86、pPEPTIDE2-tat38-61、pET-32a-tat22-101、pPEPTIDE2-tat22-101。将上述原核表达质粒分别转入E. coli BL21(DE3)中,经IPTG诱导表达,获得9种截短的Tat突变体融合蛋白PEPTIDE2-Tat1-21、PET-32a-Tat1-37、PET-32a-Tat1-61、PEPTIDE2-Tat1-72、PEPTIDE2-Tat1-86、PEPTIDE2-Tat22-86、PEPTIDE2-Tat38-61、PET-32a-Tat22-101和PEPTIDE2-Tat22-101,其相对分子量分别约为25,400、22,000、23,100、31,300、33,200、26,900、31,100、26,400和32,600;并用Ni-NTA亲和层析法纯化目的融合蛋白。Western blot鉴定结果表明,5种含Tat N末端的Tat突变体重组蛋白( PEPTIDE2-Tat1-21、PET-32a-Tat1-37、PET-32a-Tat1-61、PEPTIDE2-Tat1-72、PEPTIDE2-Tat1-86)均与小鼠抗Tat N末端单克隆抗体呈特异性反应,而不含N末端的Tat重组蛋白及两种载体蛋白PET-32a和PEPTIDE2则与该单抗无结合反应。ELISA检测显示,4种Tat N末端缺失的融合蛋白PEPTIDE2-Tat22-86、PEPTIDE2-Tat38-61、PET-32a-Tat22-101和PEPTIDE2-Tat22-101均与兔抗全长Tat抗血清呈阳性结合反应,而两种载体蛋白PET-32a和PEPTIDE2则无此反应,表明本研究成功构建并表达出9种截短的Tat突变体融合蛋白。第二部分Tat突变体重组蛋白的免疫原性分析用含Tat N末端的PET-32a-Tat1-37、PET-32a-Tat1-48、PET-32a-Tat1-61、PEPTIDE2-Tat1-72、PEPTIDE2-Tat1-86突变体融合蛋白和天然全长Tat融合蛋白(PET-32a-Tat1-101)分别免疫新西兰兔,制备兔抗血清,以检测各Tat突变体蛋白诱导产生抗Tat N末端抗体的差异;用缺失Tat N末端的突变体PET-32a-Tat22-101免疫新西兰兔和BALB/c小鼠,制备其兔抗血清及小鼠抗血清,用以观察PET-32a-Tat22-101诱导产生针对Tat N末端之外表位的抗体情况。ELISA检测结果显示,上述Tat突变体融合蛋白和全长Tat融合蛋白诱导产生的兔抗血清或小鼠抗血清均与全长Tat蛋白呈特异性结合反应,表明Tat突变体融合蛋白较好地保留了免疫原性。然而,含Tat N末端的Tat突变体融合蛋白(PET-32a-Tat1-37、PET-32a-Tat1-48、PET-32a-Tat1-61、PEPTIDE2-Tat1-72和PEPTIDE2-Tat1-86)诱导产生的兔抗血清与Tat N末端合成肽sTat1-21反应的抗体滴度均明显偏低(抗体滴度为200至3200),而PET-32a-Tat1-101能够诱导产生较高滴度(25600)的抗N末端抗体,提示抗Tat N末端抗体的产生可能具有一定的构象依赖性。其次,Tat N末端缺失的突变体融合蛋白PET-32a-Tat22-101诱导产生的兔抗及鼠抗血清与PEPTIDE2-Tat38-101、PEPTIDE2-Tat49-101和PEPTIDE2-Tat60-101的反应性均高于全长Tat诱导产生的抗血清与它们的反应,提示Tat N末端免疫优势表位的存在有可能会掩盖Tat其他表位抗体的产生。第三部分Tat突变体重组蛋白的抗原性分析用ELISA检测观察5种Tat突变体融合蛋白( PEPTIDE2-Tat1-21、PEPTIDE2-Tat1-72、PEPTIDE2-Tat1-86、PEPTIDE2-Tat22-86和PEPTIDE2-Tat22-101)分别与先前本课题组已制备的8种兔抗Tat血清(抗全长Tat融合蛋白PET-32a-Tat1-101兔血清,以及抗PET-32a-Tat22-72、抗PET-32a-Tat38-101、抗PET-32a-TatCC、抗PET-32a-TatCN、抗PET-32a-TatΔC、抗PET-32a-TatB41-101C和抗PET-32a-TatB41-101N兔抗血清)的反应,结果显示PEPTIDE2-Tat1-21与抗全长Tat兔抗血清的反应性最强,明显高于与其他兔抗血清的反应,表明Tat N末端Tat1-21是抗全长Tat抗体所识别的重要抗原表位。此外,Tat N末端缺失的PEPTIDE2-Tat22-86和PEPTIDE2-Tat22-101两种融合蛋白与所检测的抗Tat兔抗血清的反应存在明显差异,两者与多数兔抗血清均有良好结合反应,提示与天然Tat抗原相比,改造后的Tat突变体蛋白所诱导产生的抗Tat抗体的抗原表位谱已发生了一定改变。用原核表达的天然Tat融合蛋白PET-32a-Tat1-101以及Tat突变体融合蛋白(PET-32a-Tat1-48、PEPTIDE2-Tat1-72、PEPTIDE2-Tat1-86、PEPTIDE2-Tat38-61、PEPTIDE2-Tat38-101、PEPTIDE2-Tat49-101、和PEPTIDE2-Tat60-101)分别检测其与10例抗Tat抗体阳性艾滋病患者血清的结合反应。ELISA结果显示:(1)同一份抗Tat抗体阳性的艾滋病患者血清与不同的Tat突变体蛋白反应强度不一,其中与Tat1-86蛋白的反应性普遍较强;(2)每一种Tat突变体蛋白与不同的抗Tat抗体阳性的艾滋病患者血清反应的敏感性不同,显示出一定的特性和共性,值得进一步研究。总结:1.本研究成功构建9种HIV-1 HXB2株Tat突变体原核表达质粒并经E.coli表达,获得了9种截短的Tat突变体重组蛋白。2.所构建的5种Tat突变体蛋白( PET-32a-Tat1-37、PET-32a-Tat1-61、PEPTIDE-Tat1-72、PEPTIDE-Tat1-86和PET-32a-Tat22-101)均保留了较好的免疫原性,诱导出高滴度的与天然Tat性质不同的抗体,特别是与全长Tat蛋白相比, Tat22-101诱导产生的兔抗血清及小鼠抗血清均与N末端缺失的Tat抗原反应性增高,提示Tat N末端免疫优势表位的存在有可能掩盖Tat其他表位抗体的产生,实验结果不仅对HIV Tat分子的结构及功能的研究具有重要意义,而且也为研发有效的新型Tat疫苗奠定了基础。3.在所构建的含Tat N末端的融合蛋白中,只有全长Tat融合蛋白能够诱导产生高滴度的抗Tat N末端抗体,而含Tat N末端的截短的Tat突变体融合蛋白诱导产生抗Tat N末端抗体水平明显降低,结果提示抗Tat N末端抗体的产生可能具有一定的构象依赖性。4.初步研究显示,天然全长Tat抗原及不同截短的Tat突变体重组蛋白与抗Tat抗体阳性的艾滋病患者血清反应的强度和敏感性有所差异,其中Tat1-86与艾滋病患者血清的反应性普遍较强,初步研究结果为进一步分析和筛选临床用抗Tat抗体检测的抗原候选物提供一定的实验依据。